Meten van Trans-Plasma membraan elektronentransport door C2C12 Myotubes

Het vermogen van gezuiverde plasma membranen te beperken van elektronen acceptoren heeft geleid tot de mening dat het plasma-membraan een inherente redox capaciteit^{1 heeft}. Eerder gezien in schimmels, planten en dieren, is tPMET een proces voor meerdere organismen^2,3,4,5. Specifiek, heeft dit proces aangetoond in Saccharomyces cerevisiae, wortel cellen, erytrocyten, lymfocyten, Osteosarcoom, melanoom, macrofagen, skeletspieren en neutrofielen^{2,3, 4 , 5 , 6 , 7}. in een proces dat de elektronen in het plasma-membraan om extracellulaire oxidanten vervoert, tPMET is betrokken bij veel cellulaire functies waaronder:^5,8van de groei van de cel, cel levensvatbaarheid⁹, ijzer metabolisme¹⁰, cel^11,12,13, en bescherming van reactieve zuurstof soorten^12,14,15-signalering. Als gevolg van de tPMET de betrokkenheid in veel cellulaire functies, een verstoring van de tPMET heeft zijn hypothetische om bij te dragen aan de ontwikkeling van sommige ernstige hygiënische omstandigheden, met inbegrip van kanker¹⁶, hart-en vaatziekten¹⁷, en metabole Syndroom van¹⁸.

Er zijn meerdere manieren om te controleren van de overdracht van elektronen in het plasma-membraan, maar de meest gebruikte techniek is om te beoordelen van de vermindering van de extracellulaire elektronen acceptoren via colorimetrische testen. Veelgebruikte extracellulaire elektronen acceptoren zijn tetrazolium zouten, DPIP en FeCN²⁰c^19,ferricytochrome. De meest gebruikte tetrazolium zout is een tweede generatie zout bekend als WST-1¹⁹. Deze compound is makkelijker te gebruiken in de colorimetrische testen in vergelijking met eerste generatie tetrazolium zouten als gevolg van twee sulfonaat groepen, die haar water oplosbaarheid²¹te verhogen. WST-1, is in samenhang met de tussenliggende elektron acceptor 1-methoxy-fenazine methosulfate (mPMS), verminderd in twee single-electron transfer gebeurtenissen. Deze verlaging verandert de geoxideerde vorm van zwak-gekleurde van WST-1 tot en met een meer intense, gele formazan^20,22. WST-1 heeft een hoge molaire extinctie coëfficiënt van 37 x 10³ M^-1cm^-1, wat leidt tot een hoge assay gevoeligheid^21,22. DPIP wordt ook gebruikt als een accepteerder extracellulaire elektron te controleren tPMET. Het is aangetoond dat DPIP extracellularly kan worden verminderd door tPMET zonder de hulp van tussenliggende elektronen acceptoren^23,24. Als gevolg van het ontbreken van tussenliggende elektronen acceptoren, DPIP kan rechtstreeks pick-up elektronen uit het plasma-membraan, in tegenstelling tot WST-1²⁴. Gelijkaardig aan DPIP, FeCN heeft aangetoond dat op tPMET zonder de hulp van tussenliggende elektronen acceptoren^19,24extracellularly tot ferrocyanide worden verminderd. In tegenstelling tot WST-1 en DPIP heeft FeCN een lage molaire extinctie coëfficiënt leidt tot een lagere assay gevoeligheid⁹. Een andere veelgebruikte extracellulaire elektron acceptor te controleren van de tPMET is ferricytochrome c. vergelijkbaar met WST-1, ferricytochrome c vermindering neemt toe met het gebruik van tussentijdse elektron acceptor, mPMS²². In tegenstelling tot WST-1 echter is de ferricytochrome c methode minder gevoelig als gevolg van een achtergrond van hoge en een lage molaire extinctie coëfficiënt²².

Hier presenteren we een methode voor real-time analyse van tPMET via spectrofotometrische testen. De methode gebruikt de extracellulaire elektronen acceptoren WST-1 en DPIP, zoals ze allebei een hoge molaire extinctie coëfficiënt hebben terwijl zijn minder duur in vergelijking met de andere vaak extracellulaire elektronen acceptoren zoals ferricytochrome c gebruikte. We fenazine methosulfate (PMS) gebruikt in plaats van mPMS hebben ze een vergelijkbare chemische make-up en PMS is veel minder duur. mPMS is een fotochemisch stabiel die is een belangrijk kenmerk voor een commerciële kit die een lange houdbaarheid moet. Echter maken we PMS vers voor elke assay, dus stabiliteit niet een probleem moet. Ook presenteren we een methode voor het evalueren van mogelijke enzymatische interacties (Zie Figuur 1) tussen de extracellulaire elektron acceptor en enzymen die kunnen worden gebruikt om verder het karakteriseren van het proces van tPMET. In het bijzonder bepalen de enzymen AO en SOD kunnen worden gebruikt welk gedeelte van de tPMET is te wijten aan ascorbaat vervoer of extracellulaire superoxide release, twee veelgebruikte methoden voor elektronen worden vervoerd over het plasma-membraan.