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유전학

जड़ Microbiome की खोज: मिट्टी, Rhizosphere से बैक्टीरियल समुदाय डेटा निकालने, और जड़ Endosphere

Published: May 02, 2018
doi:
10.3791/57561
, , ,
1Department of Plant and Microbial Biology,University of California, Berkeley, 2Plant Gene Expression Center,USDA ARS

Summary

यहां, हम मिट्टी, rhizosphere, और रूट endosphere microbiomes के amplicon अनुक्रम डेटा प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । यह जानकारी संरचना और संयंत्र से संबंधित माइक्रोबियल समुदायों की विविधता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और संयंत्र प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ प्रयोग के लिए उपयुक्त है ।

Abstract

संयंत्र की मेजबानी और जुड़े सूक्ष्मजीवों के बीच अंतरंग बातचीत संयंत्र फिटनेस का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण है, और अजैव तनाव और रोगों के लिए सुधार सहिष्णुता को बढ़ावा कर सकते हैं । के रूप में संयंत्र microbiome अत्यधिक जटिल हो सकता है, कम लागत, इस तरह के amplicon आधारित अनुक्रमण 16S rRNA जीन के रूप में उच्च प्रवाह तरीकों अक्सर अपनी माइक्रोबियल संरचना और विविधता निस्र्पक के लिए पसंद कर रहे हैं । हालांकि, इस तरह के प्रयोगों का आयोजन करते समय उपयुक्त कार्यप्रणाली का चयन उन पूर्वाग्रहों को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है जो नमूनों और अध्ययनों के बीच विश्लेषण और तुलना को कठिन बना सकते हैं । इस प्रोटोकॉल का वर्णन विस्तार से मिट्टी, rhizosphere, और जड़ नमूनों से संग्रह और डीएनए के निष्कर्षण के लिए एक मानकीकृत पद्धति । इसके अतिरिक्त, हम इन नमूनों में बैक्टीरियल समुदायों की संरचना की खोज के लिए अनुमति देता है कि एक अच्छी तरह से स्थापित 16S rRNA amplicon अनुक्रमण पाइपलाइन पर प्रकाश डाला, और आसानी से अन्य मार्कर जीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इस पाइप लाइन, चारा, मक्का, गेहूं, स्ट्रॉबेरी, और agave सहित संयंत्र प्रजातियों की एक किस्म के लिए मान्य किया गया है, और संयंत्र organelles से संदूषण से जुड़े मुद्दों पर काबू पाने में मदद कर सकते हैं ।

Introduction

संयंत्र से जुड़े microbiomes बैक्टीरिया, archaea, वायरस, कवक, और अंय eukaryotic सूक्ष्मजीवों के शामिल गतिशील और जटिल माइक्रोबियल समुदायों से मिलकर बनता है । संयंत्र रोग के कारण में उनकी अच्छी तरह से अध्ययन भूमिका के अलावा, संयंत्र से जुड़े रोगाणुओं भी सकारात्मक बायोटिक और अजैव तनाव के लिए सहिष्णुता में सुधार के द्वारा संयंत्र के स्वास्थ्य को प्रभावित कर सकते हैं, पोषक तत्वों की उपलब्धता को बढ़ावा देने, और बढ़ाने के माध्यम से संयंत्र वृद्धि phytohormones का उत्पादन होता है । इस कारण से, विशेष रुचि निस्र्पक taxa है कि संयंत्र जड़ endospheres, rhizospheres, और आसपास की मिट्टी के साथ सहयोगी में मौजूद है । जबकि कुछ रोगाणुओं पर अलगाव में संस्कृति किया जा सकता है प्रयोगशाला मीडिया उत्पंन, कई नहीं, भाग में, क्योंकि वे अंय रोगाणुओं के साथ सहजीवी रिश्तों पर भरोसा कर सकते हैं, बहुत धीरे से बढ़ती है, या शर्तों है कि एक प्रयोगशाला वातावरण में दोहराया नहीं जा सकता की आवश्यकता होती है । क्योंकि यह खेती के लिए की जरूरत है दरकिनार और अपेक्षाकृत सस्ती और उच्च प्रवाह, अनुक्रम-पर्यावरण और मेजबान के वंशावली profiling-जुड़े माइक्रोबियल नमूनों की परख माइक्रोबियल समुदाय के लिए एक पसंदीदा तरीका बन गया है संरचना.

विभिन्न अगली पीढ़ी sequencing (NGS) प्लेटफार्मों1 द्वारा प्रदान की गई उपयुक्त अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के चयन सहित महत्वपूर्ण कारकों के साथ उपयोगकर्ताओं की जरूरतों पर निर्भर है: वांछित कवरेज, amplicon लंबाई, उम्मीद समुदाय विविधता, साथ ही अनुक्रमण त्रुटि दर, पढ़ें-लंबाई, और लागत प्रति रन/megabase । amplicon आधारित अनुक्रमण प्रयोगों में विचार किया जा करने की जरूरत है कि एक और चर क्या जीन परिलक्षित किया जाएगा और क्या प्राइमरों का इस्तेमाल किया जाएगा । जब डिजाइनिंग या प्राइमरों का चयन, शोधकर्ताओं अक्सर प्रवर्धन की सार्वभौमिकता और वर्गीकरण के परिणामस्वरूप amplicons से प्राप्त संकल्प के बीच tradeoffs बनाने के लिए मजबूर कर रहे हैं । इस कारण से, अध्ययन के इन प्रकार अक्सर प्राइमरों और मार्करों कि चुनिंदा microbiome के विशिष्ट सबसेट लक्षित चुना । बैक्टीरियल समुदायों की संरचना का मूल्यांकन सामांयतः एक या जीवाणु 16S rRNA जीन2,3के hypervariable क्षेत्रों के अधिक अनुक्रमण द्वारा पूरा किया जाता है । इस अध्ययन में, हम एक NGS मंच है कि बैक्टीरियल 16S rRNA जीन है, जो बैक्टीरियल taxa के व्यापक प्रवर्धन के लिए अनुमति देता है के ५०० बीपी V3-V4 क्षेत्र लक्ष्य के लिए विकसित एक amplicon आधारित अनुक्रमण प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए पर्याप्त परिवर्तनशीलता प्रदान करते हुए भी अलग taxa के बीच अंतर । इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल को आसानी से अंय प्राइमर सेट के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कवक के ITS2 मार्कर या eukaryotes के 18S rRNA उपइकाई लक्ष्यीकरण उन ।

इस तरह बन्दूक metagenomics, metatranscriptomics, और एकल सेल अनुक्रमण के रूप में अन्य दृष्टिकोण, समाधान माइक्रोबियल जीनोम और समुदाय समारोह के अधिक प्रत्यक्ष माप सहित अन्य लाभ प्रदान करते हैं, इन तकनीकों आम तौर पर अधिक कर रहे हैं वंशावली की तुलना में महंगा और गणनात्मक गहन यहां4वर्णित है । इसके अतिरिक्त, शॉटगन metagenomics और metatranscriptomics रूट के नमूनों पर प्रदर्शन मेजबान संयंत्र जीनोम से संबंधित पढ़ता का एक बड़ा प्रतिशत पैदावार, और इस सीमा को दूर करने के तरीके अभी भी5,6विकसित किया जा रहा है ।

किसी भी प्रायोगिक मंच के साथ के रूप में, amplicon आधारित रूपरेखा संभावित पूर्वाग्रहों जो प्रयोगात्मक डिजाइन और डेटा विश्लेषण के दौरान विचार किया जाना चाहिए की एक संख्या शुरू कर सकते हैं । इनमें नमूना संग्रह, डीएनए निष्कर्षण, पीसीआर प्राइमरों का चयन, और पुस्तकालय की तैयारी कैसे की जाती है, के तरीकों को शामिल किया गया है । विभिंन तरीकों काफी प्रयोग करने योग्य डेटा उत्पंन की राशि को प्रभावित कर सकते हैं, और भी अध्ययन के बीच परिणामों की तुलना करने के प्रयासों में बाधा कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, rhizosphere बैक्टीरिया को हटाने की विधि7 और अलग निष्कर्षण तकनीकों या डीएनए निष्कर्षण किट8के विकल्प का उपयोग करें,9 काफी अनुप्रवाह विश्लेषण है, जो सुराग के लिए दिखाया गया है अलग निष्कर्ष के बारे में जो रोगाणुओं मौजूद है और उनके रिश्तेदार बहुतायत । चूंकि amplicon आधारित profiling अनुकूलित किया जा सकता है, अध्ययन भर तुलना कर चुनौतीपूर्ण हो सकता है । पृथ्वी Microbiome परियोजना का सुझाव दिया है कि शोधकर्ताओं ने संयंत्र के रूप में जटिल प्रणालियों का अध्ययन संबद्ध Microbiome के आवेदन के कारण परिवर्तनशीलता को कम करने के एक साधन के रूप में मानकीकृत प्रोटोकॉल के विकास से लाभ होगा अध्ययन के बीच विभिंन तरीकों10,11। यहां, हम सबसे अच्छा प्रथाओं जहां उपयुक्त के रूप में उपरोक्त विषयों और प्रस्ताव के सुझावों के कई चर्चा ।

प्रोटोकॉल मिट्टी, rhizosphere इकट्ठा करने की प्रक्रिया को दर्शाता है, और चारा bicolor से जड़ नमूने और डीएनए निकालने एक अच्छी तरह से स्थापित डीएनए आइसोलेशन किट11का उपयोग कर । इसके अतिरिक्त, हमारे प्रोटोकॉल एक विस्तृत amplicon अनुक्रमण कार्यप्रवाह भी शामिल है, एक सामांय उपयोग NGS मंच का उपयोग कर, बैक्टीरियल समुदाय12,13,14की संरचना का निर्धारण । इस प्रोटोकॉल की जड़ें, rhizosphere के हाल ही में प्रकाशित अध्ययन में संयंत्र मेजबान की एक विस्तृत श्रृंखला में उपयोग के लिए मांय किया गया है, और जुड़े- ज्वार bicolor, Zea mays, और Triticum aestivumसहित 18 monocot प्रजातियों में से मिट्टी15। इस विधि भी अंय मार्कर जीन के साथ प्रयोग के लिए मांय किया गया है, के रूप में agave microbiome के अध्ययन में कवक ITS2 मार्कर जीन का अध्ययन करने के लिए अपनी सफल आवेदन द्वारा प्रदर्शित16,17 और स्ट्रॉबेरी microbiome 18.

Protocol

1. संग्रह और जड़ Endosphere, Rhizosphere, और मिट्टी के नमूनों की जुदाई क्षेत्र में प्रवेश करने से पहले, आटोक्लेव ultrapure पानी (नमूना प्रति पानी की कम से ९० मिलीलीटर) को निष्फल । epiphyte हटाने बफर तैयार (प्रति नमूना कम से 25 मिली?…

Representative Results

अनुशंसित प्रोटोकॉल निष्पादित कर रहा है एक dataset अनुक्रमणित युग्मित-end पढ़ता जो वापस प्रत्येक नमूने के लिए मिलान किया जा सकता और या तो एक बैक्टीरियल संचालन वर्गीकरण इकाइयां (ओटू) या सटीक अनुक्?…

Discussion

इस प्रोटोकॉल रूट endosphere, rhizosphere, और मिट्टी माइक्रोबियल समुदाय रचनाओं की खोज के लिए एक स्थापित पाइपलाइन को दर्शाता है, नमूना प्रसंस्करण और बहाव अनुक्रमण के लिए नमूना क्षेत्र से । जड़ से जुड़े microbiomes का अध्ययन अ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

यह काम USDA-ARS द्वारा वित्त पोषित किया गया (CRIS 2030-21430-008-00D) । टीएस NSF ग्रेजुएट रिसर्च फेलोशिप प्रोग्राम द्वारा समर्थित है ।

Materials

0.1-10/20 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-3810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000027 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes Eppendorf 3120000909 Can substitute with equivalent from other suppliers.
100 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000043 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1000 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1122-1830 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1620-2700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mm soil sieve Forestry Suppliers 60141009 Can substitute with equivalent from other suppliers.
200 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-8810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
25 mL reservoirs VWR International LLC 89094-664 Can substitute with equivalent from other suppliers.
50 mL conical vials Thermo Fisher Scientific 352098 Can substitute with equivalent from other suppliers.
500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) VWR International LLC 156-4020
96-well microplates USA Scientific 655900
96-well PCR plates BioRad HSP9631
Agencourt AMPure XP beads Thermo Fisher Scientific NC9933872 Instructions for use:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180&documentName=B37419AA.pdf
Aluminum foil Boardwalk 7124 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Analytical scale with 0.001 g resolution Ohaus Pioneer PA323 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Bioruptor Plus ultrasonicator Diagenode B01020001
Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL New England Biolabs B9000S
Centrifuge Eppendorf 5811000908 Including 50mL and 96-well plate bucket adapters
Cryogenic gloves Millipore Sigma Z183490 Can substitute with equivalent from other suppliers.
DNeasy PowerClean kit (optional) Qiagen Inc. 12877-50 Previously MoBio
DNeasy PowerSoil kit Qiagen Inc. 12888-100 Previously MoBio
Dry ice Any NA
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Do not substitute
Ethanol VWR International LLC 89125-188 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gallon size freezer bags Ziploc NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gemini EM Microplate Reader Molecular Devices EM Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top.
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Lab coat Workrite J1367 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 Any NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 dewar Thermo Fisher Scientific 4150-9000 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Milli-Q ultrapure water purification system Millipore Sigma SYNS0R0WW
Mini-centrifuge Eppendorf 5404000014
Molecular grade water Thermo Fisher Scientific 4387937 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Mortars VWR International LLC 89038-150 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Nitrile gloves Thermo Fisher Scientific 19167032B Can substitute with equivalent from other suppliers.
Paper towels VWR International LLC BWK6212 Can substitute with equivalent from other suppliers.
PCR plate sealing film Thermo Fisher Scientific NC9684493
PCR strip tubes USA Scientific 1402-2700
Pestles VWR International LLC 89038-166 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Plastic spatulas LevGo, Inc. 17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) Thermo Fisher Scientific 13000014
PNAs – chloroplast and mitochondrial PNA Bio NA Make sure to verify sequence bioinformatically
Protective eyewear Millipore Sigma Z759015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Qubit 3.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Qubit dsDNA HS assay kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Rubber mallet (optional) Ace Hardware 2258622 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shears or scissors VWR International LLC 89259-936 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shovel Home Depot 2597400 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Soil core collector (small diameter: <1 inch) Ben Meadows 221700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Spray bottles Santa Cruz Biotechnology sc-395278 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) IDT NA 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry.
Thermocycler Thermo Fisher Scientific E950040015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Weigh boats Spectrum Chemicals B6001W Can substitute with equivalent from other suppliers.
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References

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Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).
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