Verkennen van de wortel Microbiome: extraheren van gegevens van de bacteriële Gemeenschap uit de bodem, de rhizosfeer, en de wortel Endosphere

Plant-geassocieerde microbiomes bestaan van dynamische en complexe microbiële gemeenschappen bestaat uit bacteriën, archaea, virussen, schimmels en andere eukaryote micro-organismen. Naast hun goed bestudeerde rol bij het ontstaan van plantenziekten, kunnen plant-geassocieerde microben ook positief beïnvloeden gezondheid van planten door verbetering van tolerantie-doorbraak tot biotische en abiotische stress, bevordering van de beschikbaarheid van nutriënten en verbetering van de groei van de planten door middel van de productie van fytohormonen. Om deze reden bestaat bijzondere belangstelling in het karakteriseren van de taxa die met plant wortel endospheres, rhizospheres en de omliggende grond associëren. Terwijl sommige microben gekweekt in isolatie op laboratorium gegenereerde media worden kunnen, kunnen niet, velen voor een deel omdat ze op symbiotische relaties met andere microben vertrouwen kunnen, zeer langzaam groeien of verplichten de voorwaarden die niet kunnen worden gerepliceerd in een testomgeving. Omdat het de noodzaak voor teelt omzeilt en relatief goedkoop en high-throughput is, reeks gebaseerde fylogenetische profilering van milieu- en host-geassocieerde microbiële monsters geworden een methode voor het analyseren van de microbiële Gemeenschap voorkeur samenstelling.

De selectie van geschikte sequencing technologieën geboden door diverse volgende generatie sequencing (NGS) platformen¹ is afhankelijk van de behoeften van de gebruikers, met belangrijke factoren waaronder: gewenste dekking, amplicon lengte, verwacht Gemeenschap diversiteit, evenals sequencing foutenpercentage, lees-lengte, en de kosten-per-run/megabase. Een andere variabele die moet worden beschouwd in amplicon gebaseerde sequencing experimenten is wat gen zal worden versterkt en wat inleidingen worden gebruikt. Bij het ontwerpen of kiezen inleidingen, worden onderzoekers vaak gedwongen om compromissen tussen de universaliteit van de versterking en de taxonomische resolutie haalbare uit de resulterende waarbij. Om deze reden koos deze soorten studies vaak inleidingen en markeringen die selectief gericht zijn op specifieke deelverzamelingen van de microbiome. Evaluatie van de samenstelling van bacteriële Gemeenschappen wordt vaak bereikt door sequentiebepaling één of meer van de hypervariable regio’s van de bacteriële 16S rRNA gen^2,3. In deze studie, beschrijven we een amplicon gebaseerd sequencing protocol ontwikkeld voor een NGS-platform dat doelstellingen de 500 bp V3-V4-regio van de bacteriële 16S rRNA gen, waarmee een brede versterking van bacteriële taxa terwijl ook het verstrekken van voldoende variabiliteit te onderscheid maken tussen verschillende taxa. Bovendien, kan dit protocol gemakkelijk worden aangepast voor het gebruik met andere primer sets, zoals degenen die de ITS2 markering van schimmels of de 18S rRNA subeenheid van eukaryoten targeten.

Terwijl andere benaderingen zoals shotgun metagenomics, metatranscriptomics en eencellige sequencing, bieden andere voordelen, waaronder opgelost microbiële genomen en meer directe meting van de functie van de Gemeenschap, zijn deze technieken meestal meer duur en computationeel intensief dan de fylogenetische profilering hier^{4 beschreven}. Bovendien, een groot percentage van leest die behoren tot het genoom van de plant host uitvoeren van shotgun metagenomics en metatranscriptomics op wortel monsters opbrengsten, en methoden om deze beperking ondervangen worden nog steeds ontwikkelde^5,6.

Net als bij een experimenteel platform, kan amplicon gebaseerde profiling leiden tot een aantal potentiële vooroordelen die moeten worden onderzocht tijdens de experimentele design en data-analyse. Het gaat hierbij om de methoden van sample collectie, DNA extractie, selectie van PCR inleidingen en hoe de voorbereiding van de bibliotheek wordt uitgevoerd. Verschillende methoden kunnen beduidend beïnvloeden de hoeveelheid bruikbare gegevens gegenereerd, en kunnen ook een belemmering vormen voor de inspanningen om resultaten tussen studies te vergelijken. Bijvoorbeeld, de methode van het verwijderen van de rhizosfeer bacteriën⁷ en het gebruik van verschillende extractie technieken of keuze van DNA extractie kits^8,9 is aangetoond dat ze beduidend beïnvloeden downstream analyse, die leidt tot verschillende conclusies met betrekking tot die microben heden en hun relatieve abundanties zijn. Aangezien amplicon gebaseerde profielen kan worden aangepast, kan waardoor vergelijkingen over studies worden uitdagende. De aarde Microbiome Project heeft voorgesteld dat de onderzoekers bestuderen van complexe systemen, zoals de plant-geassocieerde microbiome van de ontwikkeling van gestandaardiseerde protocollen als een middel profiteren zou voor het minimaliseren van de variabiliteit veroorzaakt door de toepassing van verschillende methoden tussen studies^10,11. Hier bespreken we veel van de bovengenoemde onderwerpen en bieden suggesties over beste praktijken waar nodig.

Het protocol toont het proces van verzamelen bodem, rhizosfeer en wortel monsters van Sorghum bicolor en uitgepakt DNA met een gevestigde DNA isolatie kit¹¹. Daarnaast is ons protocol bevat een gedetailleerde amplicon sequencing workflow, met behulp van een algemeen gebruikte NGS-platform, om te bepalen van de structuur van de bacteriële gemeenschappen^12,13,14. Dit protocol is gevalideerd voor het gebruik in een brede waaier van plant hosts in een recent gepubliceerde studie van de wortels, rhizosfeer en bijbehorende-bodems van 18 monocot-soorten, met inbegrip van Sorghum bicolor, Zea mays, en Triticum aestivum¹⁵. Deze methode is ook gevalideerd voor gebruik met andere markers, zoals blijkt uit de succesvolle toepassing aan het bestuderen van de schimmel ITS2 marker-gen in studies van de agave microbiome^16,17 en aardbei microbiome ¹⁸.