Un protocolo de aspiración de la ampolla para estudiar células de T humanas recordar respuestas en Vivo

Este manuscrito describe un procedimiento práctico para el estudio de la memoria humana inmune respuestas en vivo, con cosecha de memoria y de la célula de antígeno cutáneo por la inducción de ampolla de succión. TST se utilizó como un ejemplo de deposición intradérmica del antígeno y el recuerdo de la vacuna BCG. Por último, un ejemplo de caracterización de muestras de SB por análisis de flujo cytometric y múltiplex del cytokine fue siempre, demostrando que aproximadamente un tercio de las células de SB fueron polifuncional específica de antígeno las células de T del fenotipo de memoria efectora.

Los pasos críticos de este protocolo incluyen la técnica de inyección intradérmica, la inducción de la aspiración de la ampolla y la ampolla perforaciones. En primer lugar, una correcta deposición intradérmica requiere a personal capacitado. Una deposición incorrecta puede conducir a resultados subóptimos. PPD es generalmente un antígeno cutáneo conocido y seguro, pero su composición puede variar entre fabricantes, limitar la comparabilidad^13,20. Este informe proporciona las instrucciones de una sola deposición intradérmica de TU 2 y opcionalmente dos declaraciones paralelas (TU 2 x 2), que pueden requerir aprobación ética adicional. Sin embargo, otros estudios han utilizado TU 10, que aumentan la probabilidad de que una piel fuerte reacción^10,21. Durante la etapa de inducción de SB, aumento gradual en la presión negativa reduce el riesgo de hemorragia y la ampolla de la ruptura. Las posibilidades de contaminación con glóbulos rojos o leucocitos de la sangre son generalmente bajos². La técnica de punción aséptica previene la contaminación microbiana y evitando el contacto entre la aguja de punción y el suelo de la ampolla cutánea reduce impurezas de desechos o células residentes de la piel. Sin embargo, algunos investigadores prefieren cosechar líquido SB aplicando una presión balanceo a la ampolla pinchado¹⁰. Puede ser necesario perforar los tabiques dentro de la ampolla. La propia técnica de SB es mínimamente invasiva; SBs colapsados curan sin dejar cicatrices y las infecciones son muy raras. ² sin embargo, puede ocurrir algún grado de la hypo-pigmentación e inducción SB probablemente debería evitarse en personas con antecedentes de cicatrización coloide.

Limitaciones técnicas incluyen la celda total bajo rendimiento y por lo tanto limitadas opciones para el almacenamiento a largo plazo. Las relaciones entre la producción de leucocitos, respuestas clínicas de TST, el tamaño de la ampolla y contaminación de eritrocitos ha sido minuciosamente descrito en otra parte^2,10. En los experimentos de BCG-memoria presentados aquí (figura 1), la producción total promedio de cada ampolla era 50.000, lo que implica un montaje experimental en pequeña escala mediante estas células, sobre todo si SBCs son estudiados solo¹⁵. Sin embargo, la población de células T específica en una muestra de SB supera sobre todo lo que se encuentra en muestras PBMC en ambos recuento absoluto y relativo. En el ejemplo presentado en la figura 2, el número de triple positivo PPD específico células de T en una muestra de 100.000 células SB fueron más de 2 x mayor que el número encontrado en 1 x 10⁶ PBMCs del mismo donante (datos no mostrados). Una calificación visual de la reacción de la TST es el más común método clínico para la evaluación de la memoria de M. tuberculosis . De la nota, la reacción inmunológica adaptativa subyacente no pico a la vez que la clínica piel reacción^2,21. No todos vacunados BCG o Mtb-individuos expuestos desarrollará fuertes reacciones de TST y estrategias para la clasificación y manejo de muestras de TST no respondedores, así como una sensibilización micobacterias preexistente en la población de estudio, hay que considerar antes de iniciar un juicio de destitución mediante este método. También, en muestreo de SB y puntuación visual, existe una posibilidad de un sesgo teórico en individuos con las respuestas de la piel reducida debido al mundial o relacionados con la piel deterioraron inmunidad como se ve, por ejemplo, en infección por el VIH y determinados grupos de edad^{2, 13,18,20}. Además, un impulso inmunológico de la reacción de TST con la prueba repetida es conocida^20,22. Sin embargo, los fenotipos celulares de SB permanecen bastante constantes cuando TSTs repetida¹⁰. Esta observación apoya el papel de la memoria de SB en estudios longitudinales de la respuesta inmune celular.

Para inmunólogos de la célula de T, llamada SB permite la cosecha de altas fracciones de células específicas de antígeno. Sin embargo, la sincronización de SB para una muestra de una deposición de PPD es fundamental como la composición celular y el microambiente de citocinas cambian con el tiempo. En el presente Protocolo, las ampollas eran inducido 7 días post desafío y las células aisladas principalmente CD4 efectoras memoria + células de T incluyendo altas fracciones de células con la expresión de IFN-γ, TNF-α y IL-2. Estas observaciones están en consonancia con estudios anteriores que describen cómo la activación, proliferación y diferenciación de células T se produce en piel preparado PPD^2,15,21. Estudios cinéticos de la SB en individuos sensibilizados PPD sugieren que la respuesta de la piel muy temprana es inespecífica; sin embargo, ya en los primeros días tras el desafío de PPD, la respuesta se convierte en dominado por células CD4 + T-(ambos fenotipos de memoria central memoria y efectoras se han descrito) y, después de 3 días, la respuesta está dominada por altas fracciones de Específicos de PPD cytokine producción de CD4 + células de T^2,8,10,15,21. Esta respuesta adaptativa del cytokine siga siendo detectable por más de 2 semanas^2,8,10,23. Día 7 post-TST parece ser el momento más óptimo para la colección de cytokine producción de células T de memoria CD4 +². Sin embargo, otros puntos del tiempo, por supuesto, puede pertinentes dependiendo del antígeno y la respuesta de interés. De nota, en un estudio, la respuesta adaptativa del PPD se ha divulgado al máximo un poco antes con una disminución en la secreción de citoquinas pro-inflamatorias ya en 5 días post-TST¹⁰.

SB líquido contiene altos niveles de citoquinas proinflamatorias y otras proteínas que se muestra para ser representante de la piel microambiente^15,24. Estudios de cinética han demostrado que TNF-α y IFN-γ niveles pico fluido SB después de 3 días al pico de los niveles de IL-2 después de 7 días^2,10, que probablemente refleja el predominio de las respuestas de adaptación a esta etapa posterior. Porque las células SB han sido activados en vivo, que exhiben una liberación de citoquinas espontáneo elevado así como un potencial para un lanzamiento específico sobre restimulation (figura 3 y 4).

Este informe se centra en la inmunidad del T-cell de CD4 +. Como se demuestra en la figura 2, era la mayoría de los aislados linfocitos T CD4 +, mientras que no hubo casi CD8 + células de T en la succión de la ampolla líquido. Esto está en consonancia con otros estudios SB PPD-memoria Informe bajas proporciones y una inferior capacidad migratoria de células CD8 + T-comparado con CD4 + T células^2,8,10,23. Era preferible una caracterización adicional de la contribución de CD8 +; sin embargo, esto está más allá del alcance de este informe.

Las células T se consideran esenciales para el control inmune de Mtb; sin embargo, ha sido difícil identificar una correlación confiable de la protección que se refleja en la respuesta inmune adaptativa del sangre^25,26. Este obstáculo impide seriamente el desarrollo de nuevas vacunas TB, como en la actualidad no existe alternativa a eficacia grandes y muy costosos ensayos²⁷. Los desarrolladores de vacunas TB determinan inmunogenicidad de la vacuna mediante la evaluación de cambios pequeños y transitorios en las poblaciones de células T de vacunas específicas en sangre^28,29. Sin embargo, es cuestionable si la pequeña fracción de células T específicas de antígeno se encuentra en la sangre que circula es relevante (es decir, capaz de migrar al sitio de una infección y representante de la t-célula-rico microambiente controla Mtb) ^{27 , 30 , 31} .

Basado en estudios anteriores y los datos presentados en este documento, el modelo de recuperación cutánea SB representa un potencial sin explotar para el estudio de las células de T de vacunas específicas. No sólo el modelo permite un recuerdo de hace una décadas de respuesta generada vacuna, también permite la evaluación de la memoria cierta potencial en un contexto de tejidos específicos^15,18,19,21. Novela, pruebas específicas de la piel, que incluyen antígenos también de candidatas a vacunas TB subunidad, sugieren nuevas oportunidades para la evaluación de vacuna usando este modelo^28,32. Además, análisis transcriptómico sugieren que una célula – inmunorespuesta transmitida por generados en piel desafió a PPD es similar a la respuesta encontrada en la Mtb-infección pulmonar¹⁸.

Mientras que las biopsias del sacador de la piel también permiten una cosecha de células de la piel y proporcionan información espacial, en comparación con el muestreo de SB, el método es más invasivo y requiere tratamiento enzimático o mecánico para preparar suspensiones celulares solo³³. Las mediciones de marcadores de cytokines y célula son comparables entre los dos métodos^2,10.

El método de aspiración de la ampolla ya se ha aplicado en muchas áreas de la investigación médica además de Dermatología, ya sea solos o en combinación con un reto de la sistémica o local de la piel. Los ejemplos incluyen estudios de sepsis, enfermedad linfoproliferativa asociada a virus de Epstein – Barr, neuropatía diabética, efectos de la ingesta de glucocorticoides y ensayos humanos anticuerpos terapéuticos o modelos para terapias dirigidas de célula T^{10 ,34,35,36,37,38}.

Desde un punto de vista terapéutico, el método de recuperación cutánea SB ofrece ventajas únicas para estudiar el potencial central de la memoria del T-cell y -de ambos biológicos y técnicos punto de vista la piel parece proporcionar un muestreo correspondiente compartimento^{2, 15,18,19,21}. En particular, en comparación con el muestreo tradicional, pasivo de PBMCs en circulación, el método de recuperación cutánea SB permite el estudio de las células T que han demostrado la capacidad de migrar desde el nodo de linfa en respuesta a su antígeno correspondiente y completar el local expansión y diferenciación de un tejido específico en vivo contexto^15,18,19,21.

En conclusión, el modelo demostrado aquí podría ser relevante para los investigadores en el campo de la inmunidad adaptativa humana y células T dirigida a agentes (es decir, en la investigación de enfermedades infecciosas vacunología o cáncer). El modelo TST aplicado en el presente Protocolo es, por supuesto, de especial relevancia en el campo de la vacunología de TB. Sin embargo, el concepto básico de este modelo es altamente aplicable en otros campos de investigación.