Um protocolo de aspiração da bolha para estudar células T humanas Recall Responses In Vivo

Este manuscrito descreve um procedimento prático para o estudo da memória humana imune respostas na vivo, usando a colheita de recordação e a célula antígeno cutâneo por indução de sucção da bolha. TST foi usado como um exemplo de deposição de antígeno intradérmico e BCG-vacina recall. Finalmente, um exemplo de caracterização de espécime SB por análise de fluxo cytometric e multiplex citocina foi fornecido, demonstrando que aproximadamente um terço das células SB foram antígeno-específicas polifuncionais T-células do fenótipo memória efetoras.

Os passos críticos do presente protocolo incluem a técnica de injeção intradérmica, a indução de sucção da bolha e a punção da bolha. Em primeiro lugar, uma correcta deposição intradérmica exige pessoal treinado. Uma deposição incorreta pode levar a resultados subótimos. PPD é geralmente um antígeno cutâneo seguro e bem conhecido, mas sua composição pode variar entre fabricantes, limitando a sua comparabilidade^13,20. Este relatório fornece instruções para um único depoimento intradérmico de 2 TU e opcionalmente dois depoimentos paralelos (2 x 2 TU), que podem exigir a aprovação ética adicional. No entanto, outros estudos têm usado 10 TU, que aumentam a probabilidade de uma reação de pele forte^10,21. Durante o passo de indução de SB, pequenos aumentos gradual na pressão negativa irão reduzir o risco de hemorragia e bolha de ruptura. As chances de contaminação com células vermelhas do sangue ou leucócitos do sangue são geralmente baixa². A técnica de punção asséptica impede a contaminação microbiana e evitando o contato entre a agulha de punção e o chão da bolha cutâneo reduz impurezas de detritos ou residente da pele células. No entanto, alguns pesquisadores preferem colher líquido SB aplicando uma pressão de rolamento para a bolha perfurado¹⁰. Pode ser necessário perfurar os septos dentro da bolha. A técnica de SB em si é minimamente invasiva; SBs recolhidos curam sem deixar cicatrizes e infecções são muito raras. ² no entanto, pode ocorrer algum grau de hipo-pigmentação e indução de SB provavelmente deve ser evitada em pessoas com antecedentes de cicatrizes coloidais.

Limitações técnicas incluem célula total baixo rendimento e, consequentemente, poucas opções para armazenamento a longo prazo. Relações entre o rendimento de leucócito, respostas clínicas do TST, o tamanho da bolha e contaminação de eritrócitos tem sido exaustivamente descrito em outra parte^2,10. Nas BCG-recordar experiências aqui apresentadas (Figura 1), o rendimento total médio de cada bolha era 50.000, implicando uma montagem experimental em pequena escala usando essas células, especialmente se SBCs são estudados só¹⁵. No entanto, a população de células T específica em uma amostra de SB principalmente excede o que é encontrado em amostras PBMC em ambas as contagens de célula relativa e absoluta. No exemplo apresentado na Figura 2, o número de triplo-positivos específicos PPD-células T em uma amostra de 100.000 células SB foram mais de 2 x maior que o número encontrado em 1 x 10⁶ PBMCs do mesmo doador (dados não mostrados). Uma pontuação de visual da reação TST é o método clínico mais comum para a avaliação da memória de M. tuberculosis . Digno de nota, a reação imunológica adaptativa subjacente não pico ao mesmo tempo como a reação de pele clínica^2,21. Não tudo BCG-vacinados ou Mtb-indivíduos expostos irão desenvolver fortes reações do TST e estratégias para a classificação e a manipulação das amostras dos TST não-respondedores, bem como uma sensibilização micobacteriana preexistente na população estudada, precisam ser considerados antes de iniciar um julgamento de recordação usando esse método. Também, em amostragem de SB e marcando visual, existe um potencial para um viés teórico em indivíduos com respostas de pele reduzida devido a global ou relacionados com pele prejudicada a imunidade, como visto, por exemplo, na infecção pelo HIV e certos grupos etários^{2, 13,18,20}. Além disso, um reforço imunológicos da reação TST com testes repetidos é conhecidos^20,22. No entanto, os fenótipos de célula SB permanecem bastante constantes quando TSTs são repetidas¹⁰. Esta observação apoia o papel de recordação do SB em estudos longitudinais de respostas imunes de celular.

Para imunologistas de células T, recordação do SB permite a colheita de altas frações de células antígeno-específicas. No entanto, o tempo do SB para uma amostragem de um depósito de PPD é crítico, tanto a composição celular e o microambiente cytokine mudar ao longo do tempo. Neste protocolo, bolhas eram induzido 7 dias pós-desafio e as células isoladas principalmente CD4 + efetoras memória T-células incluindo frações elevadas de células com uma expressão de IFN-γ e TNF-α IL-2 de co. Estas observações estão de acordo com estudos anteriores descrevendo como células T ativação, proliferação e diferenciação ocorre na pele PPD-aprontadas^2,15,21. Os estudos cinéticos SB em indivíduos PPD-sensibilizadas sugerem que a resposta inicial de pele inespecífica; no entanto, já nos primeiros dias após o PPD-desafio, a resposta torna-se dominado por células CD4 + T-(ambos os fenótipos de memória de memória e efetoras centrais foram descritos) e, depois de 3 dias, a resposta é dominada por altas frações de PPD-específicas do cytokine produzindo células T CD4 +^2,8,10,15,21. Esta resposta adaptativa cytokine permanece detectável por mais de 2 semanas^2,8,10,23. Post do dia 7-TST parece ser o ponto de tempo mais ideal para a coleção do cytokine produzindo memória CD4 + células T². No entanto, outros pontos de tempo podem, naturalmente, ser relevantes dependendo do antígeno e a resposta de interesse. De notar, em um estudo, a resposta adaptativa de PPD tem sido relatada até o máximo, um pouco mais cedo, com uma diminuição da secreção de citocinas pró-inflamatórias já em 5 dias post-TST¹⁰.

Fluido de SB contém níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias e de outras proteínas mostradas para ser representante do microambiente pele^15,24. Estudos de cinética mostraram que TNF-α e IFN-γ níveis no fluido pico SB depois de 3 dias ao pico de níveis de IL-2 após 7 dias^2,10, provavelmente refletindo a predominância de respostas adaptáveis nesta fase posterior. Porque as células SB foram registrados na vivo, eles exibem uma liberação de citocinas espontânea elevada, bem como um potencial para uma versão específica sobre restimulation (Figura 3 e 4).

Este relatório concentra-se na imunidade de células T CD4 +. Como demonstrado na Figura 2, a maioria das células-T isoladas foram de fato CD4 +, enquanto não havia quase nenhum CD8 + células T na sucção da bolha fluido. Isto está em consonância com outros estudos de PPD SB-Lembre-se, relatando proporções baixas e uma inferior capacidade migratória de CD8 + células T em comparação com as células T CD4 +^2,8,10,de²³. Uma caracterização mais da contribuição CD8 + seria preferível; no entanto, isso está além do escopo deste relatório.

As células T são consideradas essenciais para o controle imune de Mtb; no entanto, tem sido difícil identificar uma correlação confiável da proteção refletida na resposta imune adaptativa de sangue^25,26. Neste bloqueio severamente dificulta o desenvolvimento de novas vacinas de TB, como não há atualmente nenhuma alternativa aos ensaios de eficácia de grande e muito dispendiosa²⁷. Os desenvolvedores de vacina TB determinam imunogenicidade da vacina avaliando transitórias e pequenas mudanças nas populações de células T vacina específica no sangue^28,29. No entanto, é questionável se a pequena fração de células T antígeno-específicos encontradas no sangue em circulação é relevante (ou seja, capaz de migrar para o local de uma infecção e representante de controlar o microambiente de T-celular-ricos Mtb) ^{27 , 30 , 31} .

Baseado em estudos anteriores e os dados aqui apresentados, o modelo de recuperação cutânea SB representa um potencial inexplorado para o estudo de células-T de vacina específica. Não só o modelo permite um recall de uma vacina resposta gerada décadas, também permite a avaliação da memória verdadeira potencial em um contexto de tecido-específica^15,18,19,21. Romance, testes específicos da pele, que inclui antígenos também compostos de vacinas de TB de subunidade de candidato, sugerir novas oportunidades para avaliação de vacina usando este modelo^28,32. Além disso, transcriptomic análises sugerem que uma célula – mediada por resposta imune gerada em pele PPD-desafiado é semelhante à resposta encontrada no Mtb-infectados pulmão¹⁸.

Enquanto biópsias de pele soco também permitem uma colheita de células da pele e fornecem informações espaciais, em comparação com amostragem de SB, o método é mais invasivo e requer processamento mecânico ou enzimático para preparar suspensões de célula única³³. Medições de marcadores citocinas e células são comparáveis entre os dois métodos de^2,10.

O método de sucção da bolha já foi aplicado em muitas áreas de pesquisa médica, além de Dermatologia, sozinho ou em combinação com um desafio de pele local ou sistêmica. Exemplos incluem estudos de sepse, doença linfoproliferativa associada a vírus de Epstein – Barr, neuropatia diabética, efeitos de ingestão de glicocorticoide e testes em humanos teste de anticorpos terapêuticos ou modelos para terapias T-célula-alvo^{10 ,34,35,36,37,38}.

Do ponto de vista terapêutico, o método de recuperação cutânea SB oferece vantagens exclusivas para estudar a memória central de células T potencial e -de ambos um biológico e técnica do ponto de vista, a pele parece oferecer uma amostragem relevante do compartimento^{2, 15,18,19,21}. Em particular, comparado a amostragem tradicional, passiva circulantes de PBMC, o método de recuperação cutânea SB permite o estudo de células-T que provaram que a capacidade de migrar a partir do nó de linfa em resposta ao seu antígeno relevante e completar o local expansão e diferenciação em um tecido-específica no vivo contexto^15,18,19,21.

Em conclusão, o modelo demonstrou que aqui pode ser relevante para os investigadores no campo da imunidade adaptativa humana e agentes de direcionamento de células T (ou seja, na investigação de doenças infecciosas Vacinologia ou câncer). O modelo TST aplicado neste protocolo é, naturalmente, de especial relevância no campo da Vacinologia TB. No entanto, o conceito básico deste modelo é altamente aplicável em outros campos de pesquisa.