JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
암 연구학

Модель 3D Organotypic меланомы кожи сфероида

Published: May 18, 2018
doi:
10.3791/57500
,
1Experimental Dermatology, Medical Faculty,TU-Dresden

Summary

Здесь, мы представляем протокол для создания 3D organotypic сфероида меланомы кожи модели, резюмирует обе архитектуры и многоклеточных сложности орган/опухоли в естественных условиях , но в то же время вмещает систематические экспериментальные вмешательство.

Abstract

Злокачественной трансформации меланоцитов, пигментные клетки кожи человека, вызывает образование меланомы, высоки завоевательный рак с повышенной метастатическим потенциалом. Недавно моно химиотерапии продолжают совершенствовать, меланома конкретных комбинированной терапии с целевых протеинкиназы ингибиторов. Тем не менее метастатической меланомы остается угрожающих жизни заболеваний, поскольку опухоли экспонат начального сопротивления или резистентность к Роман терапии, тем самым восстановления онкогенной потенциала. Для того, чтобы улучшить терапевтический успех злокачественной меланомы, необходимо определение молекулярных механизмов, присвоении сопротивление против обычного лечения подходов; Однако это требует новаторских сотовых в vitro модели. Здесь, мы представляем в vitro трехмерные (3D) organotypic меланома сфероида модель, можно изобразить в естественных условиях архитектура злокачественная меланома и могут потребовать новое понимание внутри опухолевой а также опухоли хост взаимодействий. Модель включает в себя определенное количество сфероидов зрелой и дифференцированной меланомы в 3D кожи человека полной реконструкции модель, состоящая из клеток первичного кожи. Сотовой состав и дифференциации состояние встроенных меланомы сфероидов похож на один кожная меланома метастазов в естественных условиях. С помощью этой модели сфероида меланомы organotypic как наркотиков скрининг платформа может поддерживать идентификации ответчиков для выбранных комбинированной терапии, а бремя ненужных лечения для не ответчиков, тем самым увеличивая в интересах избавления терапевтических вмешательств.

Introduction

Человеческая кожа состоит из двух отдельных отсеков, которые выполняют различные функции в защите организма от неблагоприятных экологических последствий1. Нижнии отсек дермального состоит из фиброзно упругой соединительной ткани. Он состоит из слабо связанных коллагеновых и эластиновых волокон, синтезирован фибробластов, обслуживающих механический барьер функция. Дерма отделена от верхней эпидермиса базальной пластинки, которая производится как внеклеточная матрица из-за постоянную связь между обеими средами кожи. В отличие от дермы эпидермис является плоского эпителия, который в основном состоит из кератиноцитов и может быть дифференцирована в четыре слоя. Пласт образование состоит из недифференцированных базальных кератиноцитов, которые постоянно получают от прогениторных клеток кожи стратификации через этапы пласт игольчатый и зернистого в роговой слой для защиты тела от обезвоживания и инфекции2. Меланоциты выравниваются на базальной мембраны и общаться через дендритных расширения с несколькими кератиноцитов. Они производят пигмент меланин для защиты ткани кожи от неблагоприятного воздействия УФ-излучения, как старение кожи, иммуносупрессия, воспаление и индукции рака кожи. УФ излучения вкладом в превращение меланоцитов к злокачественной меланомы, однако, продолжается дискуссия3.

Развития меланомы делятся на разные опухоли стадии прогрессии и характеризуется определенные генетические, морфологических и гистологические изменения4. Они происходят либо de novo или из врожденной или приобретенной невус благодаря местной увеличение меланоцит распространения, вызывая злокачественные доброкачественные новообразования. Это прекурсор поражения может преобразовать в структурно измененные диспластические ткани, содержащие атипичная клетки, которые могут продолжать первый злокачественные стадии этапа радиального роста (RGP). Это ранней стадии прогрессии опухоли характеризуется клетки, радиально размножающихся в пределах эпидермиса, показаны несколько локально инвазивная клетки в пределах папиллярная дермы. В ходе последующего вертикального роста меланомы фазы (VGP) клетки уже показывают метастатических и инвазивные фенотип, прорываясь через базальной пластинки проникнуть глубже части дермы, а также в подкожной клетчатке5. Наконец метастатической меланомы (мм) представляет наиболее агрессивных стадии прогрессии с метастатическим системно распространение во всей системе крово – и лимфообращение, чтобы вторгнуться дистально органы как печени, легких и головного мозга6клеток.

На сегодняшний день, Ранняя диагностика, следуют операции по-прежнему остается наиболее эффективной терапии злокачественной меланомы. Прогноз для пациентов с отдаленных метастазов, однако, остается особенно бедных7, потому что схемы классических химиотерапии наделять только немного выживание пособие8,9. Однако после десятилетий застоя, последние достижения в целевой терапии значительно улучшили прогноз развития злокачественной меланомы.

Dysregulation два основных Митоген активации пути, рас-RAF-Мек-Эрк и PI3K-акт-PTEN сигнальных путей, настоящее время ключевых факторов прогрессии меланомы, особенно когда конститутивно активации точечные мутации BRAFV600 протоонкогенов и НКО являются настоящей10. Соответственно изобретение целевых протеинкиназы ингибиторов обещал терапевтический эффект для пациентов с метастатической меланомы. Множество клинических испытаний, проведенных на данный момент не достигнуты значительные выгоды для пациентов с метастатической меланомы. Почти все ответы частично, с субпопуляции пациентов, показаны начального сопротивления. Кроме того приобретение дополнительного сопротивления приводит к рецидиву наблюдалось в большинстве пациентов11,12.

Становится ясно, что анализ мутации статуса только не достаточно для разработки наиболее мощным терапевтической стратегии. Новые быстрые и надежные средства диагностики необходимо систематически записывать и анализировать реакцию отдельных раковых клеток. Подавляющее большинство имеющихся в настоящее время данных о человека меланомы были получены из двумерного (2D) меланомы клеточных культур. Опухолевые клетки, однако, выращенных в 3D позволяют межклеточных перекрестных помех между дифференцированный рак клеток субпопуляциям также раковые клетки и окружающие ткани хост-трансформированных. Таким образом, было бы лучше, чтобы реконструировать 3D окружающей среды, в которой разработана меланома, использоваться как доклинические скрининг модель13,14.

Protocol

Все ткани человека работа выполнялась с использованием утвержденных институциональных протоколов. 1. разделение дермы и эпидермиса из человеческой кожи (несовершеннолетних плоть от обрезания) Поместите крайней плоти (обычно 1-2 см2) в стерильных ячейки non клей культуры блюдо (Ø 10 см) и покрывают его с 10-12 мл физиологического раствора фосфатного буфера+ (PBS, MgCl 0,5 мм2, 0,9 мм CaCl2, рН 7,2 = PBS+). Удалите все избыточные (жировой) ткани, используя стерильным скальпель и щипцы. Вырезать кожу на куски 3 мм x 5 мм, мыть их с PBS и передавать их на non клей стерильные клеток культуры блюдо (Ø 6 см). Покрыть куски ткани с 5-7 мл dispase раствора (2 ед/мл в PBS). Уплотнение клетки культуры блюдо с парафином пленкой и инкубировать в течение 16 часов при 4 ° C. Убрать эпидермиса от кожной части двух стерильным пинцетом. Передача части Иссеченную ткань для отдельной ячейки non клей культуры блюда (Ø 6 см) и охватить каждый из них с PBS+. 2. изоляция первичного кератиноцитов от эпидермиса Тщательно удалите PBS+ из клетки культуры блюдо с помощью пипетки Пастера и стирать части эпидермальной ткани (раздел 1.3) с PBS. Вырезать эпидермис на более мелкие куски (1 мм2) и собирать их в 50-мл Конические трубки. Добавить 10 мл 1 x трипсина-ЭДТА (разогретую до 37 ° C) и инкубировать в течение 5 мин на водяной бане при температуре 37 ° C. Вихрь ткани подвеска каждые 2 мин. Остановите ферментативные реакции, добавив 1 мл сыворотки плода теленка (FCS). Ресуспензируйте клетки, закупорить вверх и вниз с 10 мл Пластиковые пипетки для 4 минут попытаться избежать пузырей и пенные формирования. Накапайте суспензию клеток в клетки сито (порами размером 100 мкм), укладывают поверх свежей 50 мл Конические трубки и промыть 3 x с 5 мл PBS. Центрифуга клетки на 200 x g за 5 мин Ресуспензируйте Пелле клетки в 2-6 мл питательной среды, содержащей 1% (v/v) гентамицина. Определите номер ячейки вручную путем подсчета клеток в клетках 6 x 105 Горяева и семян в колбе культуры клеток T75. 3. культивирование первичного кератиноцитов Инкубируйте первичной кератиноцитов, изолированные на шаге 2.3 в инкубаторе ячейки при 37 ° C и 5% CO2 в среде кератиноцитов без FCS, до 50-70% confluency. Для прохода кератиноцитов тщательно удалить носитель, добавить 5 мл PBS-ЭДТА и инкубации клеток в течение 10 минут при 37 ° C. Проверьте, если клетки начали отсоединиться культуру колбу под микроскопом света (4 X увеличение: клетки будет появляться округлые, но по-прежнему придает!). Если нет, замените старый PBS-ЭДТА свежие PBS-ЭДТА и повторно инкубировать еще 10 минут при 37 ° C. Добавьте 5 мл 1 x трипсина-EDTA к округлые клетки все еще покрыты 10 мл PBS-ЭДТА и повторно инкубировать их 1-3 мин при 37 ° C. Остановить ферментативные реакции, добавив 1 мл FCS и собирать отдельные ячейки в 50-мл Конические трубки. Центрифуга клетки на 200 x g 5 мин, Ресуспензируйте Пелле в средних кератиноцитов и семян 6 x 105 клеток в свежий настой культуры клеток T75.Примечание: Для создания organotypic кожи восстанавливает, первичной кератиноцитов должно использоваться не позднее, чем проход 3-4. 4. изоляция первичного фибробласты из дермы Вырезать кожных тканей (раздел 1.3) на более мелкие куски (1 мм2) и перенести их в 50-мл Конические трубки. Добавить 10 мл коллагеназы решение (5 ед/мл в PBS+) и проинкубируйте 45 мин на водяной бане при температуре 37 ° C. Центрифуга смесь кусочки ткани и клетки на 200 x g за 5 мин. Помойте лепешка клетки дважды с 10 мл DMEM содержащие 4,5 г/Л глюкозы и L-глютамином, но без L-пируват. Наконец, Ресуспензируйте куски ткани в 2 мл DMEM, содержащей 1% (v/v) гентамицина и 10% FCS. Передача их в колбе культуры клеток T25 и инкубировать их в инкубаторе ячейки при 37 ° C и 5% CO2 на ночь.Примечание: Малый объем позволяет фибробластов мигрировать из ткани мусора и заставляет их приложить к культуре колбу. На следующее утро, добавьте еще 6 мл DMEM/гентамицина/FCS и инкубировать в течение 2-3 дней при 37 ° C, до тех пор, пока клетки достигли 80-90% confluency. 5. культивирование фибробластов первичного Для прохода фибробласты, удалите среды и мыть адэрентных клеток с PBS. Добавьте 5 мл 1 x трипсина-ЭДТА и Инкубируйте 3 мин при 37 ° C. Остановить ферментативные реакции, добавив 5 мл DMEM/FCS и собирать отдельные ячейки в 50-мл Конические трубки. Центрифуга клетки на 200 x g 5 мин, Ресуспензируйте гранулы в среде DMEM и семян 6 x 105 клеток в свежий настой культуры клеток T75.Примечание: Для создания organotypic кожи восстанавливает, первичной фибробластов должно использоваться не позднее, чем прохождение 4-6. 6. поколение 3D меланомы сфероидов через повешение Drop метод Культура клетки меланомы (например, 451-Лу или любой линии клеток меланомы интереса) согласно общие протоколы, используя RPMI, содержащие 10% FCS15. Чтобы создать меланомы сфероидов аналогичного размера и качества, вымыть клетки меланомы в PBS, добавить 5 мл 1 x трипсина-ЭДТА в PBS в ячейки в T175 клетки культуры колбу и Инкубируйте 3-5 мин при комнатной температуре (RT). Нейтрализовать трипсина, добавив 5 мл RPMI/10% FCS. Урожай клетки центрифугированием на 200 x g 5 мин вновь приостановить Пелле клеток в RPMI/FCS в конечной концентрации 10 000 клеток/мл как определяется путем подсчета в Горяева. Пятно 40 x 25 мкл (= 250 клетки) суспензии клеток на внутренней поверхности крышки стерильные не клей клеток культуры блюдо (Ø 10 см) с использованием электронных мульти пипеткой. Движением быстро, но гладкая повернуть крышку и поместите его на блюдо культуры соответствующих клеток, содержащих 5 мл PBS. Культура «висит падение блюда» в инкубаторе ячейки при 37 ° C и 5% CO2 на 10-14 дней, в зависимости от типа ячейки используется.Примечание: Клетки от фазы роста мм обычно растут быстрее и образуют более прочную сфероидов в падение подвесной, по сравнению с клетки меланомы, производный от РГП или VGP. Для индивидуальной оценки наблюдать рост сфероида под бинокль или под микроскопом света (4 X увеличение). Обычно сфероидов стать обнаруживаемыми после 48 ч под бинокль или под микроскопом света (4 X увеличение). После 10-14 дней они видны без каких-либо увеличение устройства. 5 дней после первоначального падения кровянистые выделения, 10 мкл свежие RPMI/10% FCS среды в каждой капле. Впоследствии обмен 10 мкл среднего каждый день. Использование электронный распределитель является очень полезным в этом шаге. В зависимости от типа клеток урожай сфероидов (см. подробности в разделе 10) после 10-15 дней промыв их аккуратно крышку клетки культуры блюдо с PBS. Соберите их в свежие номера клей клетки культуры блюдо.Примечание: В период выращивания зависит от фазы роста опухолевых клеток меланомы когда они были первоначально получены, например, сфероидов, производный от 451-Лу клетки растут до приблизительно 500 мкм в диаметре в течение 12 дней культивирования в сокращение вися15 . 7. поколения отсеке дермального Organotypic полный кожи восстанавливает Генерировать модели кожи с помощью 24-ну клеток микропористая мембрана вставок (поры размер 8 мкм) помещены в 24-ну пластины.Примечание: Не забудьте использовать висит, но стоя вставок, потому что они будут помещены в 6-ну пластины для выращивания жидкость воздуха на более позднем этапе. Подготовьте раствор (GNL) нейтрализации гель15, а также культура СМИ называют мм и роста эндотелия СМИ (СГЭ)16,17. Для предотвращения свертывания крови, магазин коллаген типа I (обычно от крыс хвост, 3.5-4 мг/мл в 0.02 N уксусная кислота) на льду до использования, потому что он начинает гель на RT. Вновь приостановить 1 х 105 фибробластов за вставки в GNL и быстро перемешать суспензию клеток с коллагеном в соотношении 1:3 в окончательном объеме 500 мкл/вставить. Реконструировать микс от нежно закупорить вверх и вниз, чтобы избежать формирования пузыря, как пузыри могут ухудшить качество кожи. Разрешить отдельные дермального гели поселиться, сохраняя их без измеряемой среды в РТ на 30 мин в стерильных Худ. Впоследствии каждый гель накрыть DMEM, содержащие глюкозу 4,5 г/Л, 1% L-глютамином, 10% FCS и без L-пируват и Инкубируйте на ночь на 37 ° C. 8. поколения эпидермального отсек Organotypic полный кожи восстанавливает На следующий день удалить носитель из дермы гели и сбалансировать их с СГЭ СМИ (10% FCS, 1% PenStrep, гентамицин 10 мг/мл) за 2 ч при 37 ° C. Снять средства и тщательно семян 1 х 105 кератиноцитов высокомобильна в 100 мкл EGM поверх дермального гель. Инкубируйте реконструирует для 1,5 ч при 37 ° C разрешить кератиноцитов придерживаться отсеке дермы.Примечание: Это время инкубации, гели начнет сокращаться благодаря фибробластов индуцированной сокращение и таким образом, по крайней мере частично отсоединить от вставки стен. Покрытие кожи эквиваленты с примерно 800 мкл внеочередного общего собрания акционеров и тщательно удалить остаточные гель от вставки стены с небольшой (белый) пипетки наконечником. Культура кожи эквиваленты, погруженной в EGM за 7 дней в инкубаторе ячейки при 37 ° C, 5% CO2и изменения среды каждый день.Примечание: В это время эквиваленты кожи будет сокращаться значительно. 9. жидкость воздуха выращивания Organotypic полный кожи восстанавливает На 8 день передача каждого вставить в индивидуальных хорошо 6-ну плиты. Только добавьте мл 1,2-1,4 мм среды в каждой скважины, чтобы реконструировать кожу поставляется с среднего из нижней части хорошо, но не покрыта средне.Примечание: Культивирования на воздухе жидкость интерфейс позволяет стратификации часть эпидермиса и создание полного ороговевшем слое (stratum corneum). В течение следующих 10-17 дней измените носитель, как указано в разделе 9.1 каждый день. В этот период добавьте наркотиков или других раздражителей, при необходимости на носитель. Осторожно удалите реконструировать полный кожи из микропористая мембрана вставки с помощью Изогнутый пинцет для дальнейшего анализа, например, Иммуногистохимический анализ (рис. 1). 10. поколение моделей кожи сфероида Organotypic меланомы Чтобы интегрировать сфероидов меланомы в отсеке дермального organotypic полный кожи восстанавливает, тщательно промойте сфероидов (после шага 6.4) крышку висит падение клетки культуры блюдо с PBS. Собирайте 10-20 сфероидов/Вставка в стерильных ячейки non клей культуры блюдо. Осторожно удалите чрезмерную PBS с пипетка Пастера. Аспирационная сфероидов в минимальный объем EGM. На данный момент наблюдать и рассчитывать сфероидов невооруженным глазом, без каких-либо дальнейших увеличение устройства. Возьмите 10-20 сфероидов за кожи модели/гель, как указано в шаге 10.1. Передавать их на желаемый объем GNL, содержащих фибробластов (во время шага 7.3) и смешивать с коллаген типа I. От этого шага на действуйте, как описано в разделах 7.3-9.1.Примечание: Опухоль сфероидов становятся видимыми в дермальный гель как белые пятна (рис. 2)

Representative Results

Успешное лечение метастазов меланомы может быть под влиянием перекрестных помех между опухолевые клетки также между опухолью и хост-трансформированных клеток. Цель разработки моделей organotypic рака в пробирке является предоставить подходящие доклинических испытаний системы, которые пилки 3D Организации и сложности человека меланомы в vivo. Это позволяет исследования терапевтического воздействия на опухоль в среде organotypic и отрицательное воздействие на окружающие ткани первичного параллельно. Для разработки лучших моделей organotypic кожи, качество первичных элементов имеет решающее значение. Это выгодно использовать несовершеннолетних первичной фибробластов и кератиноцитов, потому что они обычно менее дифференцированы по сравнению с клеток кожи взрослых первичной. Несовершеннолетних кожи клетки может либо быть изолированы от несовершеннолетних крайней плоти, как описано в разделе протокол 1-5, но также могут быть приобретены из компаний как дородовой первичной фибробластов и кератиноцитов. Если покупки, необходимо заказать клетки от различных доноров, чтобы избежать доноров конкретных результатов, например, для лекарственной чувствительности. Весь протокол отображается как схема на рисунке 3. Контроль качества 3D полный кожи эквиваленты требует Иммуногистохимический анализ. Первое впечатление может быть получено гематоксилином-эозином (H & E) окрашивание парафиновых встроенные разделы (3 мкм). Подробный анализ качества эпидермальный дифференциации и формирования базальной пластинки между дермы и эпидермиса требует Иммуногистохимический анализ с использованием специфических антител против эпидермального стратификации маркера. Это позволяет различать недифференцированный, высокой пролиферативной клетки расположен недалеко от базальной мембраны и очень продифференцировано и между ороговевших клеток на рогового слоя путем формирования различных слоев эпидермиса . Как показано иммунной гистологической окрашивание (рис. 4), дифференцировку кератиноцитов на протяжении эпидермиса может быть достигнуто похож на нормальной кожи: главным образом недифференцированные клетки от нижних слоев эпидермиса (пласт образование и прослойки игольчатый) пятно позитивные для кератинового 14, в то время как более дифференцированных клеток от выше базального слоев (зернистого и stratum corneum) пятно позитивные для кератинового 10 и involucrin. Соответственно филлагрина окрашивания можно только наблюдать в весьма дифференцированных клеток рогового слоя. Самое главное окрашивание Ламинин 5 показывает, что базальной пластинки был сгенерирован соединиться физиологически эпидермальных кожных отсек реконструировать искусственной кожи. Это доказывает, что общение organotypic микроокружения был создан меланома клеток хозяина или сфероидов физиологического и патофизиологические анализа. Для целей наркотиков Скрининг меланомы, один меланома клеток также могут быть интегрированы в дерме эквиваленты полного кожи позволяет de novo меланомы гнездо формирования18,19. Поэтому клетки меланомы в сочетании с первичной фибробластов в соотношении 5:1, центрифугировали вместе на 200 x g 5 мин и высокомобильна в GNL до смешивания с коллагеном. В результате Гнезди клеток меланомы спонтанно сформирует в отсеке дермы. Согласно нашему опыту только клетки метастатических роста фаза надлежащей форме гнезда, по сравнению с клетки меланомы РГП или VGP15. Один главный недостаток этих типов моделей является тот факт, что количество и размер меланомы гнёзда формируется невозможно предсказать и может варьироваться между отдельными кожи восстанавливает, независимо от какого-либо лечения. Например 1000 посеяны в отсеке кожных клеток может получить 10 гнезд, состоящий из 100 клеток или 100 гнезда, состоящий из 10 клеток каждого (рис. 5). Эти биологические переменные представляют с тремя недостатками: во-первых, количество и размер меланомы гнезда сформировали непредсказуемы; Во-вторых метастазы в естественных условиях обычно больше, чем меланомы гнезда и демонстрируют более сложные интра опухолевой разнообразия; и в-третьих, из-за ограниченной продолжительности жизни опухоли гнездо моделей, лечение начинается рано и следовательно довольно подавляет опухоли нарост вместо вызывает регрессию существующих опухоли гнезда. Чтобы преодолеть эти ограничения organotypic меланомы кожи сфероида модели могут быть созданы. По культивирования 250 метастатической меланомы клетки в висит падение за 14 дней20сфероидов можно воспроизвести создаются состоящий из жизнеспособных меланомы, которую клетки, представляя Компактная структура окончательного диаметром приблизительно 500 мкм подражая не васкуляризированной опухоль узлы, микро метастазы, или между капиллярного микро регионов твердых опухолей21,22. В общем, любой линии клеток меланомы подходит для поколения сфероидов через повешение падение метод; Однако, клетки, полученные из более продвинутые формы этапов метастатические опухоли более прочную сфероидов, по сравнению с клеточных линий, полученных из ранних стадиях прогрессирования, например, РГП. Для некоторых клеток, это выгодно для формирования правильного сфероида для повышения вязкости висит падение питательной среды. Это может быть достигнуто путем добавления 10-50% метилцеллюлоза носитель культуры. Для Стоковый раствор метилцеллюлоза, автоклав 1.2 g-метилцеллюлоза вместе с магнитной перемешать бар в стеклянная бутылка 100 мл. Добавить 100 мл разогретой (60 ° C) среднего и перемешать на 20 мин при комнатной температуре и еще 1-2 ч при 4 ° C. Стоковый раствор для 2 ч в 5000 x g центрифуги и хранить вязкой супернатант при температуре 4 ° C до использования. Надлежащей проверки полного кожи Меланома сфероида моделей обеспечивается тот факт, что определенное число меланомы сфероидов можно – по крайней мере статистически – интегрироваться в дермальный фибробластов/коллагена я эшафот в день 1 конструкции модели кожи, позволяя они совместно развивать во время эпидермальный дифференциация на 25-27 дней. Доходность сфероидов можно проанализировать сразу после посева, потому что сфероидов появляются белые пятна внутри прозрачной дермального гель и может рассматриваться без каких-либо увеличение устройства (рис. 2). В результате модель 3D кожи создается сфероидов Зрелые меланомы гаваней, которые культивировали в пробирке в общей сложности приблизительно 42 дней, показать высокий уровень интра опухолевых клеток дифференциация15. H & E окрашивание кожи Меланома сфероида модель показывает гистологические внешний вид и клеточных распределение меланомы сфероидов очень похож на один из не васкуляризированной человека меланомы кожи метастазов в vivo15 (Рисунок 6 ). Два субпопуляции клеток меланомы ясно distinguishable в этих условиях: субпопуляции пролиферирующих периферической и Центральной субпопуляция, состоящий главным образом из усохшие, apoptotic или отмершие клетки, образуя так называемые «некротические» центр. Immunohistochemically жизни и пролиферирующих субпопуляций могут быть обнаружены с использованием антител против распространения маркер KI-67, тогда как клетки некротические центра могут быть визуализированы пятнать TUNEL15. Этот дистрибутив субпопуляции клеток опухоли является оправданным на сфероиде размер (пола≥500 мкм), результате нехватки питательных веществ и кислорода в центральной части, где накапливается катаболических отходов. После протокол здесь позволит создание надежных и воспроизводимых organotypic модель человека полный толщина кожи с встроенный сфероидов человека меланомы, которые имитируют человека меланомы кожи метастазов. Применение этой модели включают тестирования на наркотики, скрининг токсинов, влияние косметической соединений или лазерная терапия на меланому нарост и лечение. Рисунок 1 : Культивирование 3D organotypic кожи восстанавливает погружения с среднего и в интерфейсе жидкость воздуха. В день 0, первичной кератиноцитов посеян на вершине отсеке дермы, состоящий из первичных фибробластов встроен в коллаген типа я матрицы. 3D кожи восстанавливает остаться культивируемых погружения с EGM за 7 дней, отсоединить от вставки стены и начать сокращение. В день 8 вставки переданы 6-скважин и культивируется в жидкость воздуха интерфейс, позволяющий эпидермальный стратификации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2 : Меланома сфероидов встроен в отсеке дермального появляются как белые пятна. При подготовке дермального отсек 3D кожи реконструировать, определенное количество сфероидов меланомы могут быть добавлены к фибробластический коллаген типа я смешиваю. После того, как кожный гель осела, меланома сфероидов становятся видимыми как белые пятна. Рисунок 3 : Схема построения модели кожи 3D organotypic. Удаление жировой ткани из образца кожи и порезать на мелкие кусочки. Инкубация с раствором dispase на ночь при 4 ° C облегчает разделение эпидермис от дермы. Изолированные первичной фибробластов и кератиноцитов следует выращивается отдельно и используется между прохождение 4-6 и 3-4, соответственно. Впоследствии поколения модели 3D кожи может действуйте, как описано в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4 : 3D organotypic кожи восстанавливает Показать уровень дифференциации похож на нормальной кожи человека. Парафин слоев кожи эквиваленты (A) по сравнению с нормальной человеческой кожи (B) были витражи для выражения кератины 14 (красный: λex 554 Нм; λет 568 Нм) и 10, involucrin (зеленый: λex 490 Нм;ет 525 Нм λ ), филлагрина (зеленый: λex 490 Нм; λет 525 Нм) и Ламинин 5 (зеленый: λex 490 Нм; λет 525 Нм) и проанализированы с помощью микроскопа конфокальный флуоресценции. Клеточных ядер были визуализированы путем пятнать DAPI (синий: λex 340 Нм; λет 488 нм). Иммуногистохимическое исследование 3D полный толщина кожи эквиваленты показали надлежащего эпидермальный стратификации формируя различные слои эпидермиса, как видно в нормальной коже человека. В то время как клетки от нижних слоев эпидермиса витражи позитивные для кератинового 14, более дифференцированной клетки от выше базального слоя показал кератин 10 и involucrin окрашивание. Весьма дифференцированные клетки рядом филлагрина рогового выразил. Пятнать Ламинин 5 показывает, что базальной пластинки создается соединиться физиологически эпидермальных кожных отсека (низкая панель). Эта цифра была взята из Voersmann и др. 15 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 5 : Количество и размер спонтанно сформированных меланомы гнезда не может быть предсказано. De novo меланомы гнездо формирования в отсеке дермального полного эквиваленты может быть достигнуто путем смешивания определенное количество меланомы кожи клетки с первичной фибробласты для внедрения обоих типов клеток в коллаген типа я матрицы. Количество и размер гнезда спонтанно сформированных меланомы могут быть проанализрованы лишь от зрелой кожи 3D реконструкции после около 21 дней. Как из двух выборок (A) и (B), количество и размеры гнезд меланомы может варьироваться между отдельными кожи восстанавливает. Как следствие трудно, чтобы проверить эти модели и предсказать терапевтического воздействия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 6 : Меланома сфероидов интегрированы в кожу эквиваленты резюмировать ключевые особенности человеческого кожная меланома метастазирования. Парафиновых срезах опухоли сфероидов встроен в кожу эквиваленты запятнанных H & E показали сфероидов поделиться ключевые характеристики с-васкуляризированной человека кожная меланома метастазов в естественных условиях. Два субпопуляции клеток явно заметны: периферической жизни субпопуляции и Центральный субпопуляция, состоящий главным образом из усохшие, apoptotic или отмершие клетки, образуя «некротические» центр. Это распределение субпопуляций опухолевых клеток гарантируется сфероида размер. Этот показатель был изменен с Voersmann и др. 15 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Organotypic меланома сфероида кожи модели представил здесь гарантирует новые идеи для более глубокого понимания интра опухолевых и взаимодействие опухоли хост и может обеспечить расширенный скрининг платформу для изучения молекулярных механизмов развития опухоли и Сопротивление терапией в будущем.

Чтобы гарантировать лучшее физиологического и в естественных условиях имитируя условий кожи восстанавливает, качество первичных элементов имеет первостепенное значение. Как указывалось выше, несовершеннолетних или дородовой клетки кожи показывают низкие сорта дифференциации и поэтому лучше всего подходят для создания полной толщина кожи эквиваленты. Первый возможным контроль качества является степень дермального сокращение на 2 день после посева кератиноцитов и equilibrating гель для внеочередного общего собрания акционеров (протокол разделы 8.2 и 8.3). Кожной гели сократится наиболее с самым лучшим качеством фибробластов. Кроме того интеграции слишком мало или слишком много фибробласты могут ухудшить дермального сужением и, следовательно, приверженность эпидермального отсеке кожных. Это в свою очередь будет компромиссом эпидермальный дифференциации, потому что этот процесс требует обширных перекрестных помех между клетками дермы и эпидермиса.

Качество первичных элементов также критически зависит от confluency клеток, а также прохождение клеток. Если кератиноцитов выращиваются ≥80% confluency они немедленно остановить пролиферирующих и начинают различать. Поэтому важно, чтобы культура их в 40-70% confluency во время пассированый и использовать их не позднее, чем за проход 3-4. Фибробласты менее чувствительны, но не должны использоваться позже, чем прохождение 4-6. Пожалуйста, обратите внимание, культивированный всех начальных клеток и клеточных линий, используемый для создания organotypic сфероида меланомы кожи модели бесплатно антибиотиков, и поэтому риск загрязнения является высоким. Однако помимо антибиотиков изменяет физиологии отдельных клеток и таким образом уменьшает качество кожи эквиваленты.

В общем сфероиде образования опухоли можно от почти всех видов опухоли клеточных линий, а также от опухолевых клеток, свежезаваренным изолированы от пациента материала. Первоначальная клеточная номер и/или выращивания время для получения оптимального сфероида размеров может меняться используется тип ячейки. До размера 150-200 мкм все ячейки, включенные в сфероиде может по-прежнему достаточно поставляться с питательные вещества через простой диффузии. Только сфероидов с размерами пола≥500 мкм показывают высокую степень клеточной дифференциации и представляют собой типичные черты-васкуляризированной опухоль ткани22.

Organotypic меланома сфероид кожа модель, разработанная здесь особенно подходит для изучения взаимодействия опухоли хост и меланома наркотиков испытания в естественных условиях-как условия15. Тем не менее окружающей среды меланомы в естественных условиях даже более сложные, укрывательство разнообразные опухоли связанных типов клеток, включая клетки иммунной системы и эндотелиальных клеток. Поскольку добавление правильное иммунных клеток первичного сталкивается с проблемами с гистосовместимости, эти модели еще не способны адекватно контролировать иммунной терапевтические подходы.

Тем не менее сфероидов меланомы могут быть сгенерированы из свежевыделенных пациента материала и как только включены в полный кожи реконструировать, может служить как отдельных наркотиков скрининг платформ. Даже по интеграции штук метастазов меланомы кожи восстанавливает мыслимо для проверки комбинации препаратов в индивидуальный терапевтический подход. Включая organotypic 3D модель меланомы кожи в доклинических испытаний может помочь обеспечить, чтобы только наиболее перспективных новые терапевтические концепции учитываются вперед клинических испытаний, тем самым уменьшая коэффициент убыли потенциальных новых методов лечения для этого болезни и увеличивая скорость терапевтического успеха в клинических испытаниях.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят Hanna Voersmann для создания 3D organotypic меланома сфероид кожа модель и обеспечивая отличную протоколы. Авторы также признательны Silke Busch за ценную техническую поддержку. Работа была поддержана BMBF e: Med программа «Меланомы чувствительность» 031A423A.

Materials

fetal serum albumin (FCS) Thermo Fisher Scientific 10270106 add 10 % to cell culture medium
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300054 1X dilute in PBS
RPMI Thermo Fisher Scientific 61870010 for cultivation of melanoma cell lines
DMEM  Thermo Fisher Scientific 41965062 for cultivation of primary fibroblasts
Dispase Gibco life technologies  17105041 2U/ml, dissolve in PBS
Collagen type I BD Biosciences 354249 usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml
24-well inserts Nunclon  Nunc 140629 8 µm pore size; use standing, not hanging inserts!
cell strainer BD Falcon 352360 yellow
Gentamycine Thermo Fisher Scientific 15750060 dissolve in PBS
Keralife keratincyte medium Cell Systems do not add FCS or antibiotics
Collagenase SERVA 17454 NB4 standard grade
juvenile human keratinocytes Cell Systems FC-0007 alternative to own preparation from juvenile foreskin
juvenile human fibroblasts Cell Systems FC-0001 alternative to own preparation from juvenile foreskin
DMEM
[+] 4,5 g/l Glucose,
[+] L- Glutamine,
[-] L- Pyruvate		 Gibco life technologies 41965 mix 1:1 with Ham´s F-12 for MM medium;          mix 3:1 with Ham´s F-12 for EGM medium
Ham´s F-12 [+] L-Glutamine Gibco life technologies  21765-029 add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15)
EGF  Gibco life technologies  13247-051 add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium
Calcium chloride Merck Chemicals 2381 add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium
Selenic acid Alfa Aesar 18851 add 53 nM for the generation of EGM and MM medium
Insulin Lilly HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Ethanolamine Sigma-Aldrich  E-0135 add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium
P-Ethanolamine Sigma-Aldrich P-0503 add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium
Holo-Transferrine Sigma-Aldrich  T-0665 add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Triiodthyronine Sigma-Aldrich T-6397 add 20 pM for the generation of EGM and MM medium
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H-088816 add 0.4 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Progesterone Sigma-Aldrich P-8783 add 10 nM only for the generation of EGM medium
Hepes Sigma-Aldrich H-3784 add 15 mM for the generation of EGM and MM medium
Serine Sigma-Aldrich S-4311 add 1 mM for the generation of EGM and MM medium
Cholinchloride Sigma-Aldrich  C-7017 add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium
dFCS Sigma-Aldrich F-0392 Lot 086K0361 add 2 % for the generation of EGM and MM medium
Adenine Sigma-Aldrich  A-9795 add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium
L-Glutamine PromoCell C-42209 add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium
Strontiumchloride Sigma-Aldrich 255521 add 1 mM for the generation of EGM and MM medium
anti cytokeratin 10 antibody Dako M7002 1:50
anti cytokeratin 14 antibody Santa Cruz sc-53253 1:200
 anti laminin 5 antibody Santa Cruz sc-32794 1:50
anti filaggrin antibody Thermo Fisher Scientific MA5-13440 1:50
anti involucrin antibody Acris Antibodies AM33368PU 1:50
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled LifeSpan Biosciences LS-C153907 1:50
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled Jackson Immuno Research 115-165-003 1:1000
DAPI Sigma-Aldrich 10236276001 1:100
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boulais, N., Misery, L. The epidermis: a sensory tissue. Eur. J. Dermatol. 18 (2), 119-127 (2008).
  2. Blanpain, C., Fuchs, E. Epidermal homeostasis: a balancing act of stem cells in the skin. Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 10 (3), 207-217 (2009).
  3. Shain, A. H., Bastian, B. C. From melanocytes to melanomas. Nat. Rev. Cancer. 16 (6), 345-358 (2016).
  4. Clark, W. H. Human cutaneous malignant melanoma as a model for cancer. Cancer Metastasis Rev. 10 (2), 83-88 (1991).
  5. Hsu, M. Y., Meier, F., Herlyn, M. Melanoma development and progression: a conspiracy between tumor and host. Differentiation. 70 (9-10), 522-536 (2002).
  6. Miller, A. J., Mihm, M. C. Melanoma. N. Engl. J. Med. 355 (1), 51-65 (2006).
  7. Balch, C. M., et al. Final version of 2009 AJCC melanoma staging and classification. J. Clin. Oncol. 27 (36), 6199-6206 (2009).
  8. Eigentler, T. K., Caroli, U. M., Radny, P., Garbe, C. Palliative therapy of disseminated malignant melanoma: a systematic review of 41 randomised clinical trials. Lancet Oncol. 4 (12), 748-759 (2003).
  9. Kim, T., Amaria, R. N., Spencer, C., Reuben, A., Cooper, Z. A., Wargo, J. A. Combining targeted therapy and immune checkpoint inhibitors in the treatment of metastatic melanoma. Cancer Biol. Med. 11 (4), 237-246 (2014).
  10. Lawrence, M. S., et al. Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes. Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).
  11. Flaherty, K. T., et al. Inhibition of mutated, activated BRAF in metastatic melanoma. N. Engl. J. Med. 363 (9), 809-819 (2010).
  12. Rauschenberg, R., Garzarolli, M., Dietrich, U., Beissert, S., Meier, F. Systemic therapy of metastatic melanoma. J. Dtsch. Dermatol. Ges. 13 (12), 1223-1235 (2015).
  13. Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
  14. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
  15. Vorsmann, H., Groeber, F., Walles, H., Busch, S., Beissert, S., Walczak, H., Kulms, D. Development of a human three-dimensional organotypic skin-melanoma spheroid model for in vitro drug testing. Cell Death. Dis. 4, e719 (2013).
  16. Chen, C. S., Lavker, R. M., Rodeck, U., Risse, B., Jensen, P. J. Use of a serum-free epidermal culture model to show deleterious effects of epidermal growth factor on morphogenesis and differentiation. J. Invest. Dermatol. 104 (1), 107-112 (1995).
  17. Meier, F., et al. Human melanoma progression in skin reconstructs : biological significance of bFGF. Am. J. Pathol. 156 (1), 193-200 (2000).
  18. Sinnberg, T., et al. Inhibition of PI3K-AKT-mTOR signaling sensitizes melanoma cells to cisplatin and temozolomide. J. Invest. Dermatol. 29 (6), 1500-1515 (2009).
  19. Niessner, H., et al. The farnesyl transferase inhibitor lonafarnib inhibits mTOR signaling and enforces sorafenib-induced apoptosis in melanoma cells. J. Invest. Dermatol. 131 (2), 468-479 (2011).
  20. Foty, R. A. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
  21. Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).
  22. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol. J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).

Tags

3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin ModelTumor-host InteractionTherapeutic Intervention3D ArchitectureNon-vascularized MetastasesTumor HeterogeneityPrimary CellsMelanoma Cells 451LUMelanoma SpheroidsHanging DropSkin ReconstructsDermal Counterpart

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Müller, I., Kulms, D. A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model. J. Vis. Exp. (135), e57500, doi:10.3791/57500 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image