Qui, presentiamo un protocollo per la modulazione dell’espressione del transgene utilizzando pEUI(+) singolare gene interruttore di tebufenozide trattamento.
Controllo preciso dell’espressione del transgene è auspicabile in studi biologici e clinici. Tuttavia, poiché la funzionalità binaria di gene attualmente impiegati interruttori richiede il trasferimento di due unità di espressione terapeutica simultaneamente in una singola cella, l’applicazione pratica del sistema per la terapia genica è limitato. Per semplificare il sistema di espressione del transgene, abbiamo generato un interruttore gene designato come pEUI(+) che comprende un set completo di moduli di espressione del transgene in un singolo vettore. Che comprende il dominio di legame al DNA di GAL4 e modificate EcR (GvEcR), un dominio di attivazione VP16 minimal fuso con un dominio di legame al DNA di GAL4, così come un recettore di ecdisone di Drosophila (EcR), modificato l’opzione di nuova concezione singolare gene è altamente sensibile alla somministrazione di un induttore chimico in un modo dipendente dal tempo e dal dosaggio. Il vettore di pEUI(+) è uno strumento potenzialmente potente per migliorare il controllo dell’espressione del transgene in studi pre-clinici e ricerca biologica. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la modulazione di un’espressione del transgene transiente e stabile utilizzando il vettore pEUI(+) dal trattamento di tebufenozide (Teb). Inoltre, condividiamo importanti linee guida per l’uso di Teb come un induttore chimico.
Numerose opzioni differenti del gene sono stati esplorati per la loro capacità di regolare con precisione l’espressione del transgene in colture cellulari e modelli animali, con vari gradi di successo1,2,3. Sistemi di interruttori potenziale gene devono soddisfare diversi criteri rigorosi, tra cui: direzionale precisa espressione del transgene, la risposta dose – e tempo-dipendente di induttori, trascurabile permeabilità del promotore, reversibilità del transgene attivazione attraverso la rimozione di induttore e livelli di tossicità induttore tollerabili da linee cellulari e laboratorio animali1,2,3. Parecchi induttori di piccole molecole sono stati sfruttati, tra cui tetraciclina4,5, rapamicina6,7,8, mifepristone9,10, ed ecdisone11,12,13,14. In generale, questi sistemi richiedono almeno due plasmidi contenenti due o tre unità di espressione discreti, uno o due dei quali comporre un elemento normativo (plasmide induttore) che associa un induttore di piccola molecola di acquisire attività trascrizionale; e un altro plasmide (plasmide effettrici) contenente il transgene sotto il controllo di una regione di DNA normativo che consente l’accesso dell’elemento normativo associato a induttore. Lo svantaggio principale del sistema binario è che richiede l’introduzione concomitante di due vettori (induttore ed effettrici) nella cella di destinazione. Negli esperimenti di espressione del transgene transitoria, la transfezione simultanea di due plasmidi produce inevitabilmente una popolazione delle cellule che è singolarmente transfettate con l’induttore o l’effettore, o co-trasfettate diversamente. Inoltre, il sistema binario richiede almeno due turni di selezione antibiotica per stabilire linee cellulari stabili, che è lunga e laboriosa. Così, combinando tutti i componenti necessari per l’espressione del transgene e regolamento in un singolo vettore sarebbe l’ideale per garantire l’espressione concomitante di tutti gli elementi richiesti in una singola cella e consentire la regolazione dell’espressione del transgene attraverso il trattamento con induttori di piccola molecola.
Per superare le carenze delle opzioni binarie gene, abbiamo sviluppato recentemente un interruttore gene singolare, utilizzando una Drosophila melanogaster genica basati su EcR sistema inducibile15. Ecdisone media l’espressione genica quando si lega all’eterodimero EcR/ultraspiracle (USP), che a sua volta induce il legame dell’EcR al DNA elementi regolatori3,11. Il recettore di vertebrati retinoide X (RXR), un gene ortologo di insetto USP, reclute EcR per formare un attivatore trascrizionale attivo16. Così, per l’espressione mirata di un transgene in tessuto o cellule dei vertebrati, l’EcR e RXR deve essere co-espressi contemporaneamente prima di essere stimolata da ecdisone o suoi agonisti. Poiché la funzionalità heterodimeric dello switch basati su EcR gene può essere influenzata dalla endogeno RXR livello, Paolessi et al. sostituito i domini di legame al DNA di EcR e attivazione con eterologa GAL4 DNA-binding, herpes simplex virus proteina vmw65 domini di attivazione (VP16) fuso a dominio legante-legante EcR, che poi è diventato insensibile a RXR endogeno e formate un omodimero per ottenere l’attività trascrizionale17. L’interruttore del gene basati su EcR è stata ulteriormente migliorata con la costruzione di una proteina chimerica composta da minimo VP16 attivazione dominio combinato con GvEcR, che formava un omodimero e localizzata nel citosol in assenza dell’agonista ecdisone, Teb16, 18. Legandosi agli Teb, la GvEcR ha cambiato la sua localizzazione subcellulare dal cytosol al nucleo di riconoscere un promotore ibrido composto da zebrafish E1b promotore minimo combinato con un tandem dieci ripetute sequenze di attivazione a Monte (UAS) per avviare la trascrizione del gene bersaglio16.
Per semplificare il gene precedentemente segnalato basati su EcR interruttori16,18, abbiamo combinato le caratteristiche binarie del sistema in un singolo vettore dotato di tutti gli elementi richiesti per l’espressione del transgene stimolante e quindi designato il vettore appena generato, pEUI(+) (numero di accessione GenBank: KP123436, Figura 1A)15. L’effettore risponde al GvEcR driver (driver di seguito) è costituito da dieci tandem UAS ripete accanto un promotore minimo E1b seguito da un polylinker (MCS) con sequenze di riconoscimento EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI e AflII (Figura 1B). Inoltre, per facilitare la selezione di transfected le cellule, una con puromicina promotore-driven di SV40 N-acetile-gene della transferasi (PAC) è stato collocato tra le regioni pilota ed effettrici di mantenere linee cellulari stabili (Figura 1).
Descriviamo un protocollo dettagliato per la modulazione transiente e stabile di espressione del transgene utilizzando pEUI(+). Inoltre, forniamo istruzioni dettagliate per l’utilizzo corretto di Teb come un agonista di ecdisone.
Lo svantaggio principale dell’utilizzo di un interruttore di espressione genica binario è la necessità di trasportare contemporaneamente due plasmidi separati (driver ed effettrici) nella cella di destinazione. Questo può portare a una distribuzione iniqua dei plasmidi e causare una risposta incoerente dell’interruttore a induttori1,2,3. Altro difetto del sistema due-vector è che un minimo di due turni di selezione antibioti…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano S-Y Choi (Università nazionale di Chonnam) per i preziosi commenti e lettura approfondita del nostro manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da un fondo di ricerca dell’Università nazionale di Chungnam.
pEUI(+) | TransLab | The patent license was transferred to TransLab Inc. | |
Gene-Fect Transfection Reagent | TransLab | TLC-001 | |
HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
Tebufenozide | Fluka | 31652 | |
Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
Puromycin | Corning | 58-58-2 | |
Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
Trypsin-EDTA | Welgene | LS015-01 | |
DMEM | Welgene | LM001-05 | |
Fetal Bovine Serum | Welgene | S001-01 | |
Cell culture dish | SPL life science | 11090 | |
mouse FLAG M2 | Sigma | F3165 | |
anti-alpha tubulin antibody | Calbiochem | CP06 | |
Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410.1 | |
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent |
Thermo Fisher | 78505 | |
100X Protease inhibitor Cock. III | T&I | BPI-9200 |