Tillgänglighet av somatiska SCs är avgörande för regenerativ medicin, sjukdom modellering och att få inblick i SC boenden. Presenterar här vi experimentella strategier att programmera om, in vitro, åtskillnad mellan vuxna celler till deras motsvarande utbyggbart vävnadsspecifika stam/stamceller av övergående uttryck för den enda transkriptionell samtidig aktivatorn YAP.
Här presenterar vi protokoll för att isolera primära differentierade celler och slå dem i stammen/stamceller (SCs) av samma härstamning av övergående uttryck av transkriptionsfaktor YAP. Med den här metoden omvandlas luminala differentierade (LD) celler från mus mjölkkörtlar till celler som uppvisar molekylära och funktionella egenskaper mjölkkörtlar SCs. YAP också vänder fullt differentierade pankreas exokrina celler i bukspottskörteln kanalen-liknande stamfäder. Likaså att kroppsegna, naturliga SCs, kan YAP-inducerad stamceller-liknande celler (”ySCs”) så småningom utökas som organoid kulturer lång sikt in vitro utan ytterligare behov av ektopisk YAP/TAZ, som ySCs är begåvad med en ärftlig själv förnya SC-liknande tillstånd.
Omplanering proceduren presenteras här erbjuder möjligheten att generera och expandera in vitro- stamceller av olika vävnad källor från differentierade celler. Enkel utbyggnad av somatiska celler ex vivo har konsekvenser för regenerativ medicin, för förståelse mekanismer tumör insättande och, mer generellt, för cell- och utvecklingsbiologi studier.
Vävnadsspecifika somatiska stamceller (SCs) är kritiska för vävnad förnyelse och reparation efter skada. Möjligheten att enkelt isolera och obegränsat expandera ex vivo somatiska SCs representerar en kritisk fråga för potentiella regenerativ terapier samt för SC tillämpningar inom grundforskning och sjukdom modellering. Framsteg i denna riktning, har dock varit begränsat av svårigheten att fånga SC delstaten olika epiteliala organ in vitro. Faktiskt i flera vuxna vävnader bosatt SCs kan finns inte, eller inte vara lättillgänglig eller deras antal och regenerativ potential kan urholkas av åldrande eller sjukdom förhållanden. 2016 började vi fylla denna lucka genom att rapportera det uttrycket för en enda transkriptionell coactivator, YAP (Ja-associerade protein) eller dess närbesläktade protein TAZ (transkriptionell aktivator med en PDZ motiv), till terminalt differentierade celler effektivt skapar funktionella, utbyggbart, icke-tumörframkallande, autologa cellpopulationer som är operativt och molekylärt oskiljbara från deras motsvarande vävnadsspecifika SCs1. En puls av ihållande YAP eller TAZ aktivitet för dagarna är tillräcklig för att framkalla utseende själv förnya somatiska SCs. Detta är ett stabilt tillstånd som inte längre beroende av kontinuerlig transgenens uttryck, eftersom det kan överföras genom cell generationer utan vidare uttryck för ektopisk YAP/TAZ1. Protokollet presenteras här Detaljer förfarandet används för att generera de novo epitelial stem-/ stamceller i bröstkörteln och bukspottkörtel, start från differentierade cellerna i dessa vävnader. Detta förfarande fyller en svart låda i nuvarande omprogrammering/transdifferentiation arena. Viktigaste insatser i dessa riktningar har verkligen hittills centrerad på cell övergången till tillståndet inducerade pluripotenta stamceller (iPSC), följt av omvandlingen av dessa embryonala och pluripotenta SCs in mer differentierade celler. IPSCs är dock tumörframkallande en gång infördes i vuxna vävnader, att öka behovet av att utveckla protokoll för deras kompletta och effektiva differentiering2. Men kommer denna differentiering steg, även när det är möjligt till priset av långsiktiga utbyggnad, självorganisering och orgel återinsättning potentialer. Dessa är viktiga attribut för orgel regenerering som i själva verket är typiska bara av endogena vävnadsspecifika SCs och för närvarande beskrivs YAP-inducerad SCs (ySCs). På samma sätt differentierade direkt transdifferentiation av en celltyp till en annan med hjälp av cocktails av olika transkription faktorer också generera celler som saknar grundläggande proliferativ och stemness potentiella3.
Förfarandet beskrivs här tar också nytta av den nyligen införda organoid tekniken, som endogena SCs kan utvidgas och differentierade ex vivo4. YAP-inducerad SCs kan generera organoid-bilda SCs även i experimentell, biologiska eller sjukdom förhållanden där endogena SCs inte är närvarande. Vi vill påpeka att typ av cell plasticitet förmedlade av YAP på skillnaden med andra omplanering förfaranden, kan motsvara den enda formen av reversion till SC-liknande status som förekommer i levande vävnader. Återlåsning av SC-liknande egenskaper har förknippats med vävnad reparera eller onkogena aktiveringen5. Även om dispensable för homeostas av flera vuxna vävnader, är YAP och/eller TAZ absolut nödvändigt för regenerering, tumörtillväxt och expansion av somatiska SCs i vitro1,6,7,8 ,9,10,11,12
Här presenterar vi protokoll för att programmera ex vivo terminalt differentierade epitelceller i olika vävnader i deras motsvarande vävnadsspecifika stamceller (eller ySCs) av övergående uttryck av YAP, som tidigare rapporterats1. Vi har detaljerade två förfaranden: en så att omprogrammering av FACS-renat celler genom lentiviral vektorer och en andra som undviker virusinfektion och tar fördel av transgena YAP uttryck. Varje protokoll presenterar en effektiv strategi för att isolera och odla primära differentierade celler och en strategi för att tvinga exogena YAP genuttryck i differentierade celler, genererar de novo somatisk vävnad-specifika utbyggbart stamceller (se system i figurerna 1A och 2A).
Vi visat att isolering strategier här presenteras effektivt isolera en ren population av differentierade celler, vilket framgår av det faktum att vi aldrig upptäckt någon utväxt från negativa kontrollprover (siffrorna 1 c och 2 C).
Lentiviral vektorer används i denna studie för omprogrammering av primära mjölkkörtlar LD celler är doxycyklin inducerbara, erbjuder möjligheten att en sträng kontroll av transgenens uttryck; Detta gör för att slå på och av exogena YAP uttryck vid kommer. Särskild uppmärksamhet bör placeras i undvika användning av en överdriven viral titer, eftersom detta kan vara skadligt i form av omprogrammering effektivitet. När det gäller primära acinar celler bytte vi till en fullt transgena strategi att få en YAP-beroende omprogrammering med minimal manipulationer. Denna sistnämnda strategi är också speciellt lämplig för primära bukspottskörteln acini, som isolerade acinar kluster är knappast mottaglig för lentiviral infektion och mycket ömtålig. Den transgena strategi anställd erbjuder samma fördel av doxycyklin-beroende lentiviral vektorer för tight kontroll av genuttryck. Transgena strategin utnyttjas med primära bukspottskörteln acini bär dessutom den extra fördelen av en mycket högre omplanering effektivitet jämfört med viral-inducerad omprogrammering av mjölkkörtlar LD celler. Utöver olika inneboende plasticitet är associerad till celler som härrör från olika vävnader, kan den högre frekvensen av bukspottskörteln omprogrammering härledas från uttryck som är associerat till enhetliga och självständiga YAP uttryck i alla högre effektivitet explanterad celler. Vi har bland annat visat att exogena YAP inte längre behövs efter generation av ySCs (yMaSC kolonier och yDucts), utan att det påverkar deras självförnyelse kapacitet. Detta beror på att ySCs återaktivera endogena YAP/TAZ och använda dem för självförnyelse när exogena YAP är avstängd1.
Vi validerat uppfattningen att ySCs verkligen ur differentierade celler genom att kontrollera cellen ursprungsland i våra omplanering experiment genom genetiska härstamning-tracing valideringar1.
Omfattande karakteriseringav ySCs visar att YAP-inducerad omprogrammering genererar normal somatisk SCs1 som jag) på transcriptomic nivå, ySCs Visa massiva överlappningar med infödda SCs; (II) ySCs Visa differentiering potentiella och kan generera en Multilinjärt avkomman alltid begränsad till identiteten på deras vävnad ursprung. (III) ySCs är icke-omvandlad och icke-tumörframkallande när transplanterade i vivo.
Här beskriver vi också förfaranden för att upprätthålla och utveckla kultur både yMaSCs och yDucts som organoids inbäddade i 100% basalmembranet matrix hydrogels. Dessa villkor tillåta för självorganisering av ySCs i tredimensionella organoids som garanterar upprätthållandet av stemness egenskaper långsiktiga i kultur, gör det möjligt att expandera dessa stamceller populationer på kommer för nedströms analyser och applikationer. Av okänd anledning, vi misslyckats med att få yMaSC organoids genom att placera infekterade LD celler direkt i organoid odlingsbetingelser 7 dagar efter doxycyklin behandling i plast vävnadsodling plattan; med andra ord, är de mellanliggande tillväxt steget i mjölkkörtlar kolonin villkor viktigt. I våra händer kräver även infödda MaSCs mjölkkörtlar kolonin förhållanden innan passaging i organoid kultur. Dessutom erhålls den effektivaste organoid utväxten när vi undvika separera primära kolonierna i enstaka celler, men snarare överför intakt kolonierna till organoid odlingsbetingelser.
Organoid odlingsbetingelser bära också fördelen av att ge möjlighet att frysa ySCs, förutsatt att organoids återvinns från deras matriser, undvika cell dissociation innan frysförvaring i kväve bad.
Den YAP omprogrammering proceduren presenteras kan konvertera olika differentierade celltyper som härrör från olika vuxna vävnader i deras motsvarande vävnadsspecifika stamceller (vi har testat det med hjälp av mjölkkörtlar, pankreas och neuronala celler)1. Till skillnaden från iPSCs eller andra omplanering ansträngningar, kan YAP/inducerad SCs underhålla minnen av deras vävnad av ursprung. Notera de differentiering av somatiska celler in i celler med stam-liknande egenskaper är den enda formen av cell öde plasticitet och omprogrammering observerade in vivo, till exempel efter vävnadsskada och stödja sårläkning5,17 , 18 , 19 , 20. det är anmärkningsvärt att YAP och TAZ är till stor del överflödiga för normala homeostas men avgörande för vävnad reparera i flera vävnader11,21. Konsekvent med en fysiologisk funktion av omplanering stegen som här beskrivs, har YAP/TAZ nyligen visat att krävas i intestinal förnyelse i musmodeller av patienter med ulcerös kolit genom att orsaka en omvandling av vuxen intestinala celler in i en reparation epitel som visar funktioner av fostrets gut19. YAP omprogrammering således expanderar de nuvarande inducerad cell plasticitet strategierna genom att tillhandahålla ett sätt att generera somatiska stamceller, en stat som hittills har utmanande för att fånga in vitro. Detta tillvägagångssätt, kan om utvidgas också till människa celler, ha bred betydelse från regenerativ medicin program till studien i den somatiska stemness staten och för expansion av somatiska stamceller celler in vitro.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar F. Camargo för gåvan av tetO-YAPS127A möss; R26-rtTAM2 möss (lager #006965) köptes från The Jackson Laboratory. Vi tackar Chiara Frasson och Giuseppe Basso för hjälp med FACS förfaranden. Detta arbete stöds av AIRC särskilda Program molekylär klinisk onkologi ” 5 promille ” och en AIRC PI-Grant till S.P och epigenetik flaggskeppsprojekt CNR-Miur beviljar för S.P. Detta projekt har fått finansiering från de Europeiska forskningsrådet (ERC) under EU: s Horisont 2020 för forskning och innovation (bidragsöverenskommelse DENOVOSTEM nr 670126).
10 mL sterile syringes | Rays | 10LC | |
100 mm cell strainer | Corning | 352360 | |
15 mL sterile conical tubes | Corning | 430052 | |
24-well ultra low attachment plates | Costar | 3473 | |
40 mm cell strainers | Corning | 352340 | |
48-well multiwell plates | Corning | 353078 | |
50 mL sterile conical tubes | Corning | 430290 | |
6-well multiwell plates | Corning | 353046 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634028 | |
B27 supplement (50x) | Gibco | 17504001 | |
BPE | Gibco | 13028014 | |
BSA | Sigma | A9418 | |
Collagenase, type I | Sigma | 17018029 | |
dexamethasone | Sigma | D4902 | |
Dispase | Gibco | 1705-041 | |
Disposable scalpels | Swann-Morton | 0503 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
DMSO | Sigma | D2650 | |
DnaseI | Roche | 11284932001 | |
doxycycline hyclate | Sigma | D9891 | |
EDTA | Sigma | E5134 | |
Ethanol 100% | Sigma | 51976 | |
FACS tubes (with strainer caps) | Falcon | 352235 | |
FBS | Gibco | 10270106 | |
FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM) | BioLegend | 118208 | |
FUdeltaGW-rtTA | Addgene | #19780 | |
FUW-tetO-EGFP | Addgene | #84041 | used as negative control |
FUW-tetO-MCS | Addgene | #84008 | used as negative control |
FUW-tetO-wtYAP | Addgene | #84009 | |
FUW-tetO-YAPS94A | Addgene | #84010 | used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant) |
GlutaMax | Gibco | 35050061 | |
HBSS | Gibco | 24020117 | |
HCl | Sigma | 30721 | |
heparin sodium salt | Sigma | H3149 | |
HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
human R-Spondin1 (His Tag) | Sino Biological | 11083-H08H-5 | |
Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506 | |
ITS-X | Gibco | 51500056 | |
K-14 antibody | Life Technologies | Ab7800 | |
K-8 antibody | Life Technologies | Ab14053 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail) | BD Biosciences | 51-9003632 | |
Matrigel® Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
NaOH | J.T.Baker | 0402 | |
NH4Cl | Sigma | A9434 | |
Nicotinamide | Sigma | 72340 | |
non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish ø 94) | ROLL | 18248 | |
PBS 10x | Euroclone | ECM4004XL | |
PE Hamster Anti-Mouse CD61 | BD Biosciences | 553347 | |
PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f | BD Biosciences | 551129 | |
PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody | BioLegend | 102222 | |
Pen/Strep (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Rat Tail Collagen I (coating) | Sigma | 122-20 | |
Rat Tail Collagen I for 3D culture | Cultrex | 3447-020-01 | |
recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
recombinant murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
recombinant murine FGF basic (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
RPMI 1640 medium | Gibco | 31870025 | |
SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max) | Sigma | T6522 | |
Tris BASE | Roche | 11814273001 | |
Trypsin-EDTA 0,05% | Gibco | 25300054 | |
Waymouth medium | Gibco | 31220023 |