创新 RNA原位检测技术在 D1-Alpha 鼠伏隔核中多巴胺受体的鉴定
Summary
在伏隔核中多巴胺 D1-alpha 受体的鉴定对于澄清中枢神经系统疾病中 D1 受体功能障碍至关重要。我们进行了一个新的 rna 原位杂交检测, 以可视化单个 RNA 分子在特定的大脑区域。
Abstract
在中枢神经系统中, D1-alpha 亚型受体 (Drd1α) 是最丰富的多巴胺 (DA) 受体, 在调节神经元生长发育中起着至关重要的作用。然而, Drd1α受体异常调解行为反应和调节工作记忆功能的机制尚不清楚。本研究采用一种新的 RNA原位杂交方法, 从伏隔核 (NAc) 区和黑质地区的大相关电路中确定多巴胺 Drd1α受体和酪氨酸羟化酶 (TH) RNA 的表达,分别.Drd1α在 NAc 中的表达式显示了一个 “离散点” 染色模式。Drd1α表达的性别差异明显。相比之下, TH 显示了 “聚集” 的染色图案。对于 TH 表达, 雌性大鼠比雄性动物显示每个细胞更高的信号表达。本文的方法提供了一种新的原位杂交技术, 用于调查中枢神经系统疾病进展过程中多巴胺系统功能障碍的变化。
Introduction
巴多巴胺系统的功能失调涉及多种认知疾病的临床症状进展。多巴胺 D1 受体存在于脑前额皮质 (PFC) 和巴区域, 严重影响认知过程1, 包括工作记忆、时间处理和机车行为2,3,4,5,6,7. 以往的研究表明, 多巴胺 D1 受体的变化与注意缺陷多动障碍 (ADHD)8的进展有关, 精神分裂症9的认知症状10和应力易感性11。具体地说, 在精神分裂症中, 正电子发射断层扫描 (PET) 研究表明, 前额皮质多巴胺 D1 受体的结合能力与认知缺陷和阴性症状的存在有很大关系11。多巴胺 D1 受体调节的前额皮质兴奋神经元的树突生长缓解了应激敏感性。此外, D1 受体在内侧前额皮质 (mPFC) 神经元中的击倒可以增强社会失败应激引起的社会回避12。
在这里, 我们介绍了一种新的 rna原位杂交技术, 以可视化的单一 RNA 分子在细胞与新鲜冰冻组织样本。目前的技术比现有文献中存在的方法有多种优势。首先, 目前的程序保留了组织的空间和形态背景, 并进行了新鲜冷冻组织样本, 以便其他程序需要新鲜的, 非嵌入组织可以结合目前的方法。福尔马林固定和石蜡嵌入组织的类似程序表明, 可以使用 RNA原位杂交技术13实现单转录分辨率。RNA 在单一转录水平上的检测提供了对低拷贝数表达的卓越敏感性, 同时也有机会将基因表达与其他核酸检测方法无法实现的单个细胞水平进行比较,如聚合酶链反应 (PCR) 技术。此外, 目前的方法通过高度特异的 rna 探针, 通过与单目标 rna 转录的杂交, 并在检测中按顺序绑定到信号放大分子的级联来维持高信噪比的图像。系统.最后, 目前的技术提供了一个机会, 以评估多个生物系统与其特定目标专有探针, 而不是限制我们的调查只有一类系统相关的标记, 如蛋白质检测免疫组化方法。
在我们的研究中, 我们使用这种新的 RNA原位杂交来评估 Drd1α受体表达在伏核 (NAc) 和酪氨酸羟化酶 (TH) 表达在黑质 (信噪比) 中的男性和女性 F344/N 大鼠。创新的 RNA原位杂交使我们能够同时调查影响 da 吸收和大释放的机制, 提高我们对巴 da 系统复杂性的理解。这里, 我们描述了新鲜冰冻脑切片的程序, 并提供了不同染色模式的数据分析方法: “离散点” 或 “簇”。
Protocol
Representative Results
Discussion
在本协议中, 我们描述了一种新的用于新鲜冷冻脑切片的原位杂交技术, 以评估伏核 (NAc) 和酪氨酸羟化酶 (TH) 在黑质 (信噪比) 区的表达 Drd1α受体表达。我们还提供了不同染色模式的数据分析方法: “离散点” 或 “簇”。
包括了成功的多重荧光 RNA原位杂交试验的关键步骤。一旦斩首鼠, 取出大脑, 在5分钟内将大脑冷冻在液氮中. 保持大脑部分在-20 °c 直到4% 多聚甲醛固?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
目前的工作得到了国家卫生研究院 (NIH) 赠款 HD043680、MH106392、DA013137 和 NS100624 的支持。部分基金由 NIH T32 的生物医学行为科学培训补助金提供。
Materials
| HybEZ Oven system | Advanced Cell Diagnostics | 310010 | |
| RNAscope Probe – Rn-Drd1a | Advanced Cell Diagnostics | 317031 | Color channel 1, Green |
| RNAscope Probe – Rn-Th-C2 | Advanced Cell Diagnostics | 314651-C2 | Color channel 2, Orange |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Tissue-Tek vertical 24 slide rack | Fisher Scientific | NC9837976 | |
| Tissue-Tek staining dish | Fisher Scientific | NC0731403 | |
| Precision General Purpose Baths | ThermoFisher Scientific | TSGP28 | |
| Pretreatment 4 | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Amp 1-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 2-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 3-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 4-FL-Alt A | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| EZ-C1 software package | Nikon Instruments | version 3.81b | |
| SAS/STAT Software | SAS Institute, Inc., | version 9.4 |
References
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