Denne undersøgelse udforsker den roman brug af enzym-baserede mikroelektrode array (MEA) teknologi til at overvåge i vivo neurotransmitter aktivitet i smågrise. Hypotesen var, at glutamat dysregulering bidrager til mekanismen af bedøvelsesmiddel neurotoksicitet. Vi præsenterer her, en protokol for at tilpasse MEA teknologi for at studere mekanismen af anæstesi-induceret neurotoksicitet.
Hvert år underkastes millioner af børn anæstesi til en lang række procedurer. Men undersøgelser i både dyr og mennesker har sat spørgsmålstegn sikkerhed af anæstesi hos børn, implicere anæstetika som potentielt giftige for hjernens udvikling. Hidtil har ingen undersøgelser har med held belyst mekanismer som anæstesi kan være neurotoksiske. Dyreforsøg tillade undersøgelse af sådanne mekanismer, og neonatal smågrise repræsenterer en fremragende model til at studere disse virkninger på grund af deres udviklingsmæssige slående ligheder til den menneskelige hjerne.
Denne protokol tilpasser brugen af enzym-baserede mikroelektrode array (MEA) teknologi som en ny måde at studere mekanismer af anæstesi-induceret neurotoksicitet (AIN). MEAs aktiverer real-time overvågning af i vivo neurotransmitter aktivitet og tilbyder ekstraordinære tidsmæssige og rumlige opløsning. Det er en hypotese at bedøvelsesmiddel neurotoksicitet skyldes delvis af glutamat dysregulering og MEAs tilbyder en metode til at måle glutamat. Roman gennemførelsen af MEA teknologi i en Grisling model præsenterer en unik mulighed for undersøgelse af AIN.
Hvert år underkastes millioner af børn anæstesi invasive og non-invasiv procedure i USA1. For år, har anæstesi udbydere beroliget forældre sikkerheden af anæstetika, selv i små børn og nyfødte. I 1999 blev det imidlertid konstateret at forbigående blokering af N-methyl-D-aspartat (NMDA) undertype af glutamat-receptorerne under opvækst kunne forårsage udbredt neuronal apoptose i rotter2. For nylig, FDA udgivet en drug sikkerhed kommunikation, der kræver etiketter af bedøvende medicin til at omfatte en advarsel om generelle anæstetika og deres potentielle negative indvirkning på udviklingslandene hjernerne hos børn yngre end 3 år gammel (u. s. Food og Drug Administration, 2017). Der er dog stadig behov for at belyse mulige mekanismer og potentielle neuroprotektive foranstaltninger.
Normal aktivitet af neurotransmittere som glutamat og gamma-amino smørsyre (GABA) er kritiske for normale nervesystemets udvikling at forekomme. Selv om de fleste af de veje, der er involveret i AIN er stadig undvigende, er neurotransmitter-systemer meget sandsynligt, at være involveret, eftersom anæstetika er kendt for at modulere disse veje for at producere bevidstløshed. Især forårsager excitatoriske neurotransmitter glutamat excitotoxicity, når dens aktivitet er dysregulated. Denne neurotransmitter er normalt involveret i neurogenese, neural plasticitet, synaptic og neural vækst og en række andre kritisk vigtige hjernefunktioner. Men langvarig aktivering af glutamat-receptorerne kan forårsage excitotoxicity og neuronal apoptose, især under stress tilstande som kirurgi, ilt afsavn og reduceret energi tilgængelighed3. Binding af glutamat til NMDA har receptoren vist sig at forårsage Na+ og Cl− tilstrømning. Den efterfølgende depolarisering menes at føre til Ca2 + -kanal åbningen og frigivelse af intracellulære Ca2 + gemmer4. Denne dysfunktion sandsynligvis fører til en kaskade af metaboliske derangements, som i sidste ende mindske neuronal spredning, øge betændelse, og føre til neuronal død. Trods disse hypoteser forbliver de sande mekanismer af AIN uklart5. På grund af sin rolle i apoptose repræsenterer glutamat dysregulering en roman pathway, der kan bidrage til mekanismen af tidligere dokumenteret neuronal apoptose, en funktion i AIN.
En af hindringerne på studiet af neuronal processer er deres høj kompleksitet, især i fastsættelsen af neuronal udvikling. De første par måneder af livet er perioden af maksimal sårbarhed over for skade, under hvilke de fleste af de vigtige skridt af neuronal udvikling som fysiologisk apoptose (neuronal beskæring), synaptogenesis, gliogenesis og myelination finder sted6 . I betragtning af den komplekse karakter af neuronal kommunikation og vanskeligheden ved at studere disse processer uden at forstyrre normale CNS funktion, er nye teknologier blevet udviklet som sigter i vivo påvisningen og kvantificeringen af vigtige elementer af neuronal kommunikation.
Enzym-forbundet MEA teknologi blev brugt i denne undersøgelse som en ny måde at studere mekanismerne af AIN i en klinisk relevante Grisling model. Denne teknologi kan bruges til at studere kompleks i vivo elektrokemiske hjerne processer, herunder glutamat dysregulering. Indbygget 4-kanals platin optagelse lokaliteter af multilaterale miljøaftaler (2 glutamat-følsomme sites og 2 sentinel sites) tillade selvrefererende, som bidrager til registrering af nøjagtighed. Derudover en udelukkelse lag påføres hver elektrode, om selektivitet ved at forhindre andre interfererende molekyler fra at blive opdaget7. Desuden giver den lav-profil design af MEA minimal væv traumer i forhold til tidligere teknologier. Denne samme funktion giver til MEAs en højere rumlige opløsning, som letter studiet af mikroskopiske områder i hjernen. For eksempel kan diskret regioner af hippocampus (dentate gyrus, CA1, CA2) være specifikt undersøgte8. Specifikke oplysninger om funktionaliteten af multilaterale miljøaftaler har været tidligere beskrevet9.
I forhold til MEA elektrokemi, mikrodalyse inkorporerer en membran placeres mellem løsning af interesse og en løsning af lignende sammensætning, giver mulighed for påvisning af ekstracellulære væske ændrer10. Selv om mikrodalyse er en grundpille i neurochemistry og har længe været anvendt til påvisning af neurotransmittere, har det Ulempen at lave tidsopløsning, forsinket påvisning af glutamat ændring, og betydelige væv traumer11.
Multilaterale miljøaftaler kan indirekte registrere neurotransmittere som glutamat, acetylcholin og cholin, ved hjælp af passende oxidase enzymer, der producerer electroactive reporter molekyler såsom H2O2 eller O212,13 .
MEA teknologi har været meget anvendt i rotter og ikke-menneskelige primater til studiet af neurotoksicitet i forbindelse med patofysiologiske processer end AIN7,14. Blandt nogle af disse patofysiologiske processer, har MEA teknologi været brugt i studiet af Alzheimers sygdom, epilepsi, traumatisk hjerneskade og effekten af farmakologiske forbindelser på synaptic meddelelse8,15 , 16 , 17. selv om miljøaftaler har været brugt til at studere disse patologier i rotter og ikke-menneskelige primater, høj udviklingsmæssige ligheden mellem mennesker og Grisling hjerner gør tilpasning af MEA teknologi i smågrise en særdeles velegnet teknik til undersøgelsen AIN mekanismer18.
Fra starten af eksperimentet, skal Grislings fysiologiske homeostase vedligeholdes som beskrevet i denne lab forudgående offentliggørelse21. Minimal overvågningen bør omfatte pulsoximetri, Elektrokardiografi, capnography, non-invasiv blodtryk og temperatur. Uddannet efterforskere er påkrævet, så fysiologiske forstyrrelser (fx, hypo/hypertermi, hypoxi, hypotension, arytmi) kan korrigeres ordentligt.
Før induktion udføres in vitro- MEA kalibreringer for at etablere funktionalitet og selektivitet af MEA kendte betingelser. Kalibrering og klædningen af multilaterale miljøaftaler er kritisk for effektiv brug af teknologi. Der er mange potentielle fejl, der kan opstå under kalibreringen. Kalibreringen kan identificere disse spørgsmål samt forkert plating, hvilket fører til forkert interferent svar. En mere detaljeret tabelformat højde for fejl, der kan opstå i forbindelse med MEA er blevet kompileret, langs med bemærkelsesværdige årsager og forslag til løsninger, som skal bevise et nyttigt instrument for sandsynligt fejlfinding (tabel 1). Det er vigtigt at bemærke, skal checkes for tilstedeværelsen af luftbobler eller hvid misfarvning, før både kalibrering og plating, glas-referenceelektrode som enten vil negativt påvirke MEA funktion og optagelse nøjagtighed.
Symptom | Årsag | Afhjælpende foranstaltninger |
Intet Signal | Elektrode ikke tilsluttet | Korrekt forbinde elektrode til headstage og headstage til hurtig amperometry system. |
Ingen strøm til hurtig amperometry system | Slå afbryderen på bagsiden af hurtige system | |
Signal støj | Elektrode forurenet med blod | Løbende overrisle hjernen overfladen under elektrode indsættelse |
Skyl elektrode straks i dH2O | ||
Enzym belægning er løs | Ren og recoat elektrode | |
Referenceelektrode blev ikke indsat eller belagt | Pels og placere referenceelektrode længere under hovedbunden | |
Elektrode er opdage bevægelse af hjernen overflade | Forekommer normalt i overfladiske strukturer. Indsæt elektrode dybere (1 mm ad gangen) hvis det er muligt | |
Dyrs bevægelse | Dyret er utilstrækkeligt sikrede | Flytte dyret i den posteriore retning til bedre sikre earbars på kraniet. Hvis det er nødvendigt, ophøje torso at give mulighed for bedre krop justering. |
Dyret er utilstrækkeligt bedøvede | Kontrollere integriteten af det bedøvende udstyr. Titreres anæstesi til en effektiv dosis og administrere en intramuskulær rocuronium dosis (5 mg/kg) | |
Unøjagtige elektrode placering | Elektrode ikke er justeret korrekt | Justere elektroden samtidig opretholde ordentlig tilslutning til headstage. |
Stereotaxisk koordinater er urigtige | Sikre, at Grisling atlas der refereres til ikke anvender et andet referencepunkt eller fly af justering. | |
Pas på ikke at sløre sutur mærker ved at score kraniet. |
Tabel 1: instruktioner til fejlfinding MEA brug i smågrise. Mulige årsager og korrigerende foranstaltninger til at bistå med optimering og fejlfinding.
Et stereotaxisk atlas for Grisling bruges til at bestemme området af interesse med hensyn til et kendt punkt som bregma18stereotaxisk koordinater. Øre barer skal være sikret ordentligt for at sikre, at kraniet er niveau og fuldt immobiliseret. Pleje skal tages under midterlinjen indsnit i hovedbunden at undgå scoring kraniet, da dette kan påvirke visualisering af suturen linjer. Vinduet kraniotomi bør være stor nok til at rumme MEA.
Denne protokol præsenterer en række tekniske udfordringer, der kræver en velassorteret drift suite og en investigator/team dygtige i de kirurgiske og bedøvende aspekter af protokollen. Modellen præsenterer desuden finansielle begrænsninger i at Grisling model er dyrere end den gnavere model; men det er betydeligt billigere end brugen af ikke-menneskelige primater, der kan koste tusindvis af dollars. Brugen af MEA teknologi præsenterer sine egne udfordringer, som proceduren med belægning og plating elektroderne manuelt kræver en dygtig investigator eller assistent at sikre tilstrækkelig selektivitet og pålidelig funktion. Microelectrodes sig selv er skrøbelige, som de er lavet af keramik, og dermed let beskadiget, hvis ordentlig forsigtighed ikke er observeret. Microelectrodes er underlagt indblanding fra andre elektriske enheder, som kan skabe støj i optagelserne, og blod på webstedet udløsende, som kan occlude optagelse websteder. Behovet for specialiseret udstyr præsenterer en ekstra byrde, som et stereotaxisk kirurgisk ramme skal være brugerdefineret bygget til at immobilisere Grisling kraniet under implantation. Stereotaxisk rammen, glutamat oxidase og elektroderne for sig er alt dyrt. Derudover udgør manglen på en Grisling stereotaxisk atlas fra inden for det sidste årti tekniske begrænsninger, der kræver særlig ekspertise til at bestemme den specifikke placering af dybe strukturer i hjernen, Grisling. Udvikling af en ny stereotaxisk atlas, måske ved hjælp af magnetisk resonans, ville i høj grad forbedre evnen til at bruge denne teknologi i smågrise.
Grisling er en klinisk relevante model for studiet af AIN i vid udstrækning de paralleller, der eksisterer mellem denne art og den menneskelige nyfødte, som begge har lignende hjernens struktur og udvikling. I modsætning til mere almindeligt anvendte modeller såsom mus eller rotter har Grisling en større CNS lighed for mennesker, der låner til translatability af modellens resultater. Grisling model er desuden billigere og indebærer mindre kompliceret behandling end en primat model. Grisling model er beregnet til at undersøge processen ved hvilke anæstesi kan fremkalde udviklingsmæssige neurotoksicitet, måle sit bidrag til Neurologiske skader og bekæmpe spørgsmålet om skader forårsaget af confounding variabler. For eksempel, kan blive misforstået hypoxi for skader forårsaget af anæstetika, som det har globale effekter på hjernen. Grisling er udnyttet med samme kirurgiske og bedøvende betingelser som dem, der anvendes i human medicin for at sikre troskab af resultater.
Brugen af keramik-baserede MEA teknologi fjerner flere af de ulemper forbundet med den moderne teknik for mikrodalyse. Mikrodalyse har begrænset tidsmæssige og rumlige opløsning i forhold til amperometric metoder såsom MEA, som kan løbende Optag glutamat begivenheder i flere, mikroskopiske regioner på op til 10 Hz23. Denne hurtige samplingfrekvens eliminerer den konfunderende faktor af lokaliserede neurotransmitter diffusion, der er forbundet til slow–prøveudtagningsmetoder ligesom mikrodalyse24. Desuden er MEA en mindre invasiv metode end en mikrodalyse sonde, der kan forårsage betydelige gliosis i løbet indsættelse og kan ændre neurotransmitter aktivitet på indsættelsen site22.
Tidligere undersøgelser bruger en vifte af pattedyr modeller, måleteknikker og regioner af hjernen, har demonstreret basal glutamat niveauer svarende til dem fundet ved hjælp af denne teknik. Dette tyder på, at MEA teknologi, når modellens Grisling er tilpasset giver gyldig optagelser i vivo glutamat koncentration (tabel 2).
Forfatter (år) | Optagelse teknik | Dyremodel | Alder | Hjernen region(er) | Betyde Basal glutamat koncentration (µM) |
Hascup et al. (2008)23 | MEA (enzym-baseret) | Gnaver | 20 – 24 uger | Præfrontal Cortex, Striatum | 3,3 ± 1,0; 5.0 ± 1,2 |
Hascup et al. (2010)25 | MEA (enzym-baseret) | Gnaver | 3 – 6 måneder | Hippocampus | 4.7-10.4 |
Rutherford et al. (2007)9 | MEA (enzym-baseret) | Gnaver | 3 – 6 måneder | Præfrontal Cortex, Striatum | 44.9 ± 4.7; 7.3 ± 0,9 |
Miele et al. (1996)26 | Mikrodalyse (enzym-baseret) | Gnaver | – | Striatum | 3.6 ± 0,5 |
Dag et al. (2006)27 | MEA (enzym-baseret) | Gnaver | 3 – 6 måneder | Frontal Cortex, Striatum | 1.6 ± 0,3; 1,4 ± 0,2 |
Quintero et al. (2007)28 | MEA (enzym-baseret) | Ikke – menneskelige primater | 5.3-5.5 år | Premotor Cortex, motoriske Cortex | 3.8 ± 1,7; 3.7 ± 0,9 |
Stephens mfl. (2010) 29 | MEA [Spencer-Gerhardt-2 (SG-2)] | Ikke – menneskelige primater | 11 – 21 år | Putamen | 8,53 |
Kodama et al. (2002)30 | Mikrodalyse (enzym-baseret) | Ikke – menneskelige primater | – | Præfrontal Cortex | 1.29-2.21 |
Galvan et al. (2003)31 | Mikrodalyse (enzym-baseret) | Ikke – menneskelige primater | Juvenile | Striatum | 28.74 ± 2,73 |
Under og Spencer (1993)32 | Mikrodalyse (enzym-baseret) | Menneskelige | 18 – 35 år | Hippocampus | 20.3 ± 6.6 |
Reinstrup et al. (2000)33 | Mikrodalyse (enzym-baseret) | Menneskelige | – | Frontal Cortex | 16 ± 16 |
Cavus et al. (2005)34 | Mikrodalyse (enzym-baseret) | Menneskelige | 15 – 52 år | Neocortex | 2.6 ± 0,3 |
Tabel 2. Sammenligning af basal ekstracellulære glutamat levelsacross forskellige dyremodeller. En valgte gennemgang af undersøgelser om normale ekstracellulære glutamat niveauer i sunde vågen og bedøvede dyr ved hjælp af mikrodalyse eller microelectrodes.
Brugen af MEA teknologi til at overvåge i vivo glutamat koncentrationer i modellen Grisling kan tillade den fremtidige evaluering af Grisling neurologiske udfald efter anæstesi. Overlevelse eksperimenter har været planlagt, hvilket vil yderligere en forståelse af den langsigtede virkning af anæstesi på neurokognitive trivsel menneskelige nyfødte. Overlevelse eksperimenter vil gøre det muligt for adfærdsmæssige test og overvågning af glutamat ændres længe efter anæstesi eksponering. Det er også almindeligt, at børn skal underkastes anæstesi i forhold, hvor de kan opleve fysiologiske stress i form af kirurgiske indgreb. Fremtidige undersøgelser adressering indflydelse af kirurgi neurologisk skade og stigning i neurotoksicitet ønsker mulighed for mere præcis modellering af en fælles kliniske omgivelser for børn. Brugen af alternative dyremodeller er også muligt, som er studiet af disse forskellige modeller gennem kronisk implantation, gør det muligt at spore adfærdsmæssige ændringer forbundet med neurotoksicitet. Selve MEA teknologien er alsidig, så fremtidige studie ikke behøver at være begrænset til analyse af glutamat niveauer (f.eks., GABA, cholin, lysin, osv. kunne analyseres).
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende bidragene fra University of Kentucky Center for mikroelektrode teknologi (CenMeT), og den Ohio State University laboratorium dyr ressource Center (CIRKULÆR).
Advance Liqui-Wean Pig Milk Replacer | PBS Animal Health | 292-13 | |
Piglet Anesthesia Face-Cone Mask | VetEquip | 921428 | |
Integra SL Anesthesia Workstation | DRE Veterinary | 2350 | This anesthesia workstation is chosen to best mimic the clinical monitoring experienced by pediatric patients in the operating room. Any anesthesia machine can be used as long as it allows for sufficient physiologic monitoring and intervention. |
Sevoflurane | Ultane | 0074-4456-04 | |
Rocuronium Bromide Injection | Hospira | 0409-9558-05 | |
Medfusion 4000 IV Infusion | Smiths Medical | ||
Model 1530 Heavy-Duty Research Model Stereotax | Kopf | custom made | |
Model 1541 Piglet Adaptor | Kopf | custom made | |
Infrared Spot Lamp | Amazon | B000HHQ94C | |
Bair Hugger Torso Blanket | 3M | 540 | |
Bair Hugger | 3M | 750 | |
Sterile Alcohol Prep Pad | Fisherbrand | 22-363-750 | |
Carbon Steel Rib-Back Surgical Blade | Bard-Parker | #10 | |
Scalpel Handel | Havel's | HAN-G4 | |
Surgical Scissors | World Precision Instruments | 504615 | |
Mosquito Forceps | Sklar Surgical Instruments | 17-1225 | |
Gauze Pads | Fisherbrand | 22-246-069 | |
Adson Tissue Forceps | Teleflex | 181223 | |
Dremel 111 Engraving Cutter | Amazon | Dremel 111 | |
Microelectrode Array | Center for Microelectrdoe Technology, University of Kentucky | S2 4Ch MEA; custom made | |
Headstage | Quanteon | 2pA/mV | |
Wire, silver, PFA, .008" Bare, .0110" coated | A-M Systems | 786500 | |
Fine Micromanipulator | Narishige Scientific Instrument Lab | MO-8 |