Usando o Terminal Transferase-mediada dUTP Nick End-rotulagem (TUNEL) e Caspase 3/7 ensaios a morte de células epidérmicas medida em sapos com quitridiomicose

Os anfíbios são actualmente uma as maiores perdas de biodiversidade global de qualquer vertebrado táxons¹. Das principais causas destes declínios é a quitridiomicose de doença de pele fatal, causada por patógeno fungo Batrachochytrium dendrobatidis, Bd². O patógeno infecta superficialmente a epiderme, que pode levar ao rompimento de função da pele, resultando em perda de eletrólito grave, parada cardíaca e morte³. Vários potenciais hospedeiro imune mecanismos contra Bd atualmente estão sendo estudados, tais como peptídeos antimicrobianos^4,5, flora bacteriana cutânea⁶, imune celular receptores^7,8, e linfócitos atividade^9,10. No entanto, poucos estudos exploram se morte de apoptose e célula epidérmica é um mecanismo imune contra este agente patogénico mortal.

Morte celular, por meio de apoptose (morte celular programada) ou necrose (morte sem programado), a epiderme pode ser uma patologia de infecção de Bd . Pesquisas anteriores sugerem que Bd infecção pode induzir apoptose porque interrupção das junções intracelulares é observada quando a pele explantes estão expostos a zoospore sobrenadantes em vitro¹¹. Além disso, alterações epidérmicas degenerativas em Bd-rãs infectadas são observadas usando microscopia eletrônica^12,13. Transcriptomic análises indicam que as vias de apoptose são upregulated em pele infectada¹⁴, e anfíbios splenocytes sofrem apoptose quando eles são expostos a Bd sobrenadantes em vitro¹⁵. Apesar do volume crescente de evidências sugerindo que o Bd pode induzir apoptose e anfitrião pilha morte em vitro, estudos em vivo que explore ou quantificar a apoptose mecanismos através a progressão da infecção são escassos. Além disso, é desconhecido se o host usa apoptose como uma estratégia de defesa imune para combater infecção de Bd , ou se a apoptose é uma patologia da doença.

Neste estudo, tivemos como objetivo detectar morte celular epidérmica e apoptose em animais infectados na vivo usando dois métodos: ensaio de proteínas caspase 3/7 e terminal transferase-mediated dUTP nick rotulagem final (TUNEL) em situ do ensaio. Como cada ensaio detecta diferentes aspectos da célula morte¹⁶, juntos, esses métodos fornecem uma completa compreensão dos mecanismos envolvidos na morte celular e certifique-se de uma medida exata do efeito. O ensaio do caspase 3/7 quantifica a atividade das caspases efetoras 3 e 7, que permite a quantificação de ambas as vias de apoptose intrínseca e extrínseca. Em contraste, o ensaio TUNEL detecta fragmentação de DNA, que é causada por mecanismos de morte celular, incluindo apoptose, necrose e pyroptosis¹⁷. Nós usamos o ensaio do TUNEL para investigar o local da morte de pilha dentro da epiderme dos animais clinicamente infectados e não infectados usando três seções de pele diferentes: o dorso, o ventre e a coxa de Pseudophryne corroboree. Este método identifica o site anatômico de morte celular, bem como distinguir sua localização dentro de específicas camadas epidérmicas. Em seguida, usamos o ensaio do caspase 3/7 para conduzir uma quantificação de série de tempo da apoptose durante uma infecção de 8 semanas em Litoria verreauxii alpina. Tomamos amostras de ponta de dedo quinzenal dos mesmos animais e são capazes de correlacionar a carga de infecção do patógeno com atividade da caspase 3/7.