בתיווך CRISPR אובדן ניתוח פונקציה גרגר אסטרוציטומה תאים באמצעות בתוך הרחם מבוסס-אלקטרופורציה את ההעברה של ג'ין
Summary
מחקרים אובדן-של-הפונקציה המקובלת של גנים באמצעות ההסתרה חיות לעתים קרובות היו יקרים ולגזול. מבוסס-אלקטרופורציה בתיווך CRISPR סומאטית מוטגנזה מכוונת הוא כלי רב עוצמה כדי להבין ג’ין פונקציות בתוך vivo. כאן, אנחנו מדווחים על שיטה לנתח נוקאאוט פנוטיפים מתרבים תאים של הצרבלום.
Abstract
מום מוחי לעיתים קרובות נגרמת על ידי מוטציות גנטיות. פיענוח מוטציות ברקמות נגזר החולה זיהה פוטנציאל הגורמים הסיבתיים של המחלות. כדי לאמת את התרומה של תפקוד של גנים שעברו מוטציה להתפתחות המחלה, הדור של מודלים נשיאת מוטציות היא הגישה ברור אחד. בעוד מהונדסים גנטית germline העכבר מודלים (GEMMs) הם כלים ביולוגי פופולרי ולהציג תוצאות לשחזור, הוא מוגבל על-ידי זמן ועלויות. בינתיים, שאינם germline GEMMs לעיתים קרובות להפעיל פונקציה ג’ין לחקר באופן יותר ריאלי. מאז כמה המוח מחלות (למשל, גידולים במוח) מופיעים כתוצאה סומאטית אך לא germline מוטציות, שאינם germline chimeric העכבר מודלים, שבו תאים תקינה ולא תקינה לדור בכפיפה אחת, יכול להיות מועיל עבור ניתוח מחלות רלוונטיות. במחקר זה, אנו מדווחים על שיטה אינדוקציה של מוטציות סומאטית בתיווך CRISPR המוח הקטן. באופן ספציפי, אנחנו מנוצל מותנה בטוק עכברים, שבו Cas9 ו- GFP כרוני מופעלים על ידי האמרגן חטיבתי (CMV משפר/עוף ß-אקטין) לאחר Cre-מתווכת רקומבינציה של הגנום. בעיצוב עצמי יחיד-מדריך RNAs (sgRNAs) ואת הרצף recombinase Cre, שניהם המקודדת בונה פלסמיד יחיד, נשלחו לתוך גזע אסטרוציטומה/ובתאים בשלב העוברי באמצעות אלקטרופורציה בתוך הרחם . כתוצאה מכך, תאים transfected ותאי הבת שלהם הודבקו תוויות עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), למוצא פנוטיפי ניתוחים נוספים. ומכאן, שיטה זו היא לא רק מציג המסירה הגן מבוססת-אלקטרופורציה לתוך תאים עובריים אסטרוציטומה אלא גם מציע גישה כמותית מוזרה להעריך בתיווך CRISPR פנוטיפים אובדן-של-פונקציה.
Introduction
המוח המחלות הן אחת ממחלות איומות ביותר בן תמותה. הם לעתים קרובות תוצאה של מוטציות גנטיות, dysregulation עוקבות. כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של מחלות המוח, נצחית מאמצים כדי לפענח את הגנום של בני אדם חולים גילו מספר גנים סיבתי פוטנציאליים. עד כה, חייתיים germline מהונדסים גנטית כבר נעזרו ויוו רווח-של-פונקציה (GOF) וניתוחים אובדן-של-פונקציה (LOF) של גנים כאלה המועמד. עקב התפתחות מואצת של לימודי אימות פונקציונלי, רצוי ריאלי וגמישה יותר ויוו ג’ין assay מערכת לימוד ג’ין פונקציה.
היישום של מערכת העברת גנים מבוססת-אלקטרופורציה ויוו למוח המתפתח העכבר מתאים למטרה זו. למעשה, מספר מחקרים באמצעות בתוך הרחם אלקטרופורציה הראו את הפוטנציאל שלהם לערוך ניתוחים פונקציונליים לפיתוח המוח1,2,3. למעשה, במספר אזורים במוח העכבר, כגון קליפת המוח4, רשתית העין5, diencephalon6, hindbrain7, מוח מאורך8וכן השדרה9 סומנו על ידי המסירה הגן סומאטית . מתקרב, עד כה.
אכן, ביטוי גנים ארעי על-ידי ויוו אלקטרופורציה על מוח העכבר מתחלקים שימש זמן לניתוח GOF. טכנולוגיות מבוססות transposon אינטגרציה הגנומי האחרונות נוסף זמין לטווח ארוך ו/או תנאי ביטוי של גנים של ריבית10,11, אשר מהווה יתרון לנתח ג’ין פונקציה בצורה מרחבית טמפורלית במהלך פיתוח. בניגוד GOF ניתוח, ניתוח LOF כבר יותר מאתגר. בזמן ארעי תרביות תאים של siRNAs, נושא shRNA פלסמידים בוצעה, השפעות ארוכות טווח של LOF של גנים לא מובטח בשל ההשפלה בסופו של דבר exogenously הציג חומצות גרעין, כגון פלסמידים ו- dsRNAs. עם זאת, הטכנולוגיה CRISPR/רשויות אישורים מספק של פריצת דרך LOF בניתוח. גנים קידוד חלבונים פלורסנט (למשל, ה-GFP) או חלבונים מייצרים אור (למשל, גחלילית לוציפראז) יש כבר transfected במשותף עם CRISPR-Cas9 sgRNAs כדי לסמן את התאים חשופים CRISPR Cas9-בתיווך מוטציות סומאטית. יחד עם זאת, גישה זו אולי יש מגבלות במחקרים פונקציונלי על תאים מתרבים מאז סמן אקסוגני גנים מדולל והשפילו לאחר התפשטות לטווח ארוך. בעוד התאים transfected ותאי הבת שלהם לעבור מוטציות CRISPR-induced הגנום שלהם, טביעות הרגליים שלהם אולי תלך לאיבוד לאורך זמן. לפיכך, גישות תיוג גנטי יהיה מתאים להתגבר על בעיה זו.
לאחרונה פיתחנו שיטה המבוססת על CRISPR LOF בתאים גרגר אסטרוציטומה עוברים התפשטות לטווח ארוך במהלך שלהם בידול12. להוספת תווית גנטית התאים transfected, אנו נבנה על פלסמיד נושא של sgRNA יחד עם Cre , מוחדרים פלסמיד את cerebella של עכברים Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP13 באמצעות אלקטרופורציה בתוך הרחם . בניגוד וקטורים פלסמיד רגיל קידוד EGFP, גישה זו בהצלחה עם התווית גרגר transfected נוירון מבשרי (GNPs) ותאי הבת שלהם. שיטה זו מספקת תמיכה גדולה בהבנת ויוו התפקוד של הגנים של עניין מתרבים תאים המוח נורמלי ופיתוח רקע הגידול נוטה.
Protocol
Representative Results
Discussion
באמצעות אלקטרופורציה exo הרחם , בעבר דיווחנו מבוסס-siRNA ויוו פונקציונלי ניתוחים של Atoh1 בשלב מוקדם של גרגר אסטרוציטומה תא בידול8. הודות siRNA דילול/השפלה של חשיפה של עוברי מחוץ לחומה הרחם, ניתוח פנוטיפי של התאים גרגר electroporated היה מוגבל העובריים. עם זאת, השיטה הנוכחית איפשרה נ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מעריכים את לורה Sieber, אנה Neuerburg, יאסין הרים, פטרה Schroeter לקבלת סיוע טכני. אנו מודים גם ד”ר ק’ Reifenberg, ק’ Dell ועמ’ Prückl לקבלת סיוע מועיל עבור ניסויים בבעלי חיים-DKFZ; הדמיה הליבה במתקני את DKFZ ו קרל Zeiss במרכז DKFZ עבור מיקרוסקופיה קונפוקלית הדמיה. עבודה זו נתמכה על ידי פתוח, קה 4472/1-1 (כדי D.K.).
Materials
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | – | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | – | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | – | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | – | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
References
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling. Nat Commun. 6, 7391 (2015).
- Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling. Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).
- Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord. Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).
- Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system. J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).
- Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells. Oncogene. , (2017).
- Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme. Nat Commun. 8, 14758 (2017).
- Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature. 7 (11), 901-903 (2010).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), e53303 (2016).
- Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. Cellular and molecular basis of cerebellar development. Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18 (2013).
