En protokol for hurtig CRISPR/Cas9-medieret gen forstyrrelser i mus og primære hæmatopoietisk menneskeceller er beskrevet i denne artikel. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins er indført via elektroporation med sgRNAs genereret gennem in vitro- transskription og kommercielle Cas9. Høj redigering effektivitet opnås med begrænset tid og finansielle omkostninger.
Fremskridt i feltet hæmatopoietisk stamcelle (HSCs) har været hjulpet af metoder til genetisk ingeniør primære stamceller samt dyremodeller. Komplet gen ablation i HSCs kræves generation af knockout mus hvorfra HSCs kunne isoleres, og genet ablation i primære menneskelige HSCs var ikke mulig. Viral transduktion kunne bruges til knock-down tilgange, men disse lidt fra variabel effekt. I generelle, genetisk manipulation af mennesker og mus hæmatopoietisk celler var hæmmet af lav effektivitet og omfattende tid og omkostninger forpligtelser. For nylig, CRISPR/Cas9 har drastisk udvidet evne til ingeniør DNA i pattedyrsceller. Dog har anvendelsen af CRISPR/Cas9 til hæmatopoietisk celler været udfordrende, hovedsagelig på grund af deres lave Transfektion effektivitetsfordele, toksicitet af plasmid-baserede tilgange og den langsomme ekspeditionstid for virus-baserede protokoller.
En hurtig metode til at udføre CRISPR/Cas9-medieret gen redigering i murine og menneskelige hæmatopoietisk stilk og stamfader celler med knockout virkningsgrader på op til 90% er fastsat i denne artikel. Denne metode udnytter en ribonucleoprotein (RNP) levering strategi med en strømlinet tre-dages arbejdsproces. Brugen af Cas9-sgRNA RNP giver mulighed for en hit-and-run tilgang, at indføre ingen udefrakommende DNA-sekvenser i genomet af redigerede celler og reducere off target effekter. RNP-baseret metode er hurtig og ligetil: det kræver ikke kloning af sgRNAs, virus forberedelse eller specifikke sgRNA kemiske modifikation. Med denne protokol, bør forskere kunne med held generere udskæringer af et gen af interesse i primære hæmatopoietisk celler inden for en uge, herunder stilstandstider for oligonukleotid syntese. Denne tilgang giver mulighed for en meget bredere gruppe af brugere at tilpasse denne protokol til deres behov.
Fremkomsten af CRISPR/Cas9 har radikalt forenklet gen redigering i pattedyrsceller. Tidlig CRISPR/Cas9 protokoller udnyttet plasmid eller virus-baserede levering af Cas9 protein og sgRNA1,2,3. Disse tilgange viste sig at være revolutionerende for udvikling af cellulære og animalske modeller og også med held har anvendt til primær hæmatopoietisk stilk og stamfader celler (HSPCs)4,5. Men disse metoder har en række ulemper. For det første forbliver gen forstyrrelser effektivitet ofte under 50%4,5. Selv om dette er tilstrækkeligt til at generere knockout (KO) kloner i cellelinjer, gør nødvendighed for kortfristede kultur HSPCs ikke indstillet til en sådan strategi. For det andet begrænser kravet om kloning mængden af sgRNAs, der kan afprøves i enkelt eksperimenter og genererer store, svært at transfect konstruktioner. Tredje, disse tilgange tvinger forskere til at bremse turnaround-tider.
For at overvinde disse begrænsninger, vores gruppe udviklet og for nylig udgivet en alternativ CRISPR/Cas9 tilgang i HSPCs ved hjælp af Cas9-sgRNA ribonucleoproteins (RNPs)-baseret levering6. I denne strategi, de rå komponenter i CRISPR (Cas9 protein og in vitro- transskriberet sgRNA) er pre-kompleksbundet og direkte leveret til målceller via elektroporation (figur 1). Halveringstiden for Cas9-sgRNA RNP komplekset er kortere end tid at plasmid eller virus nukleinsyre er transskriberet, off-målet er lavere i forhold til tidlige tilgange7. Derudover fordelen RNP tilgang af at fjerne enhver kilde af eksogene DNA, som tilfældigt kan integrere i target cell genom fører til cellulær transformation.
Denne protokol er baseret på en strømlinet arbejdsproces for RNP-baserede gen forstyrrelser eksperimenter, som vist i figur 1. Det første skridt at designe og bestilling primere for hver sgRNA. Disse primere udnyttes for at gøre sgRNA DNA skabeloner, der bruges til in vitro- transskription (IVT) for at få sgRNAs. Renset sgRNAs er derefter inkuberes med tidligere købte Cas9 protein, at form Cas9-sgRNA RNP komplekser. Endelig, pre-kompleksbundet Cas9-sgRNA RNPs er electroporated i celler. Efter elektroporation, redigering effektivitet kan afprøves og in vitro-/i vivo eksperimenter kan startes, afhængigt af behov. Nedenstående en detaljeret beskrivelse af denne innovative eksperimenterende tilgang kan findes.
RNP fremgangsmåden i denne detaljerede protokollen giver mulighed for effektiv gen knockout i både mus og primære hæmatopoietisk menneskeceller samt som suspension cellelinjer. Selv om meget høj KO effektivitetsgevinster er ofte opnået, skal flere kritiske variabler overvejes. Første, ordentlig exon valg er afgørende for at sikre, at effektiv indel indarbejdelse svarer til gen knockout. To vigtige faktorer relateret til exon valg er bevarelse på tværs af isoformer og exon position inden for udskrifter. Isoform udtryk mønstre er variabel i hele celletyper, så eventuelt gen KO på tværs af celletyper exons der er invariante mellem cellens typer skal være målrettet. Isoform mønstre kan kontrolleres ved hjælp af q-PCR eller RNA-sekvens data. Exon position inden for udskrifter, er det bedst at målrette tidlige exons som frameshift mutationer i terminalen eller næstsidste exon kan undslippe nonsens-medieret henfald10, producerer proteiner med roman eller ukendte funktioner snarere end sande null-værdier.
Bestemmelse af indel er frekvens et afgørende skridt til at anslå KO effektivitet og korrekt fortolke biologiske resultatet af eksperimentet. Endonucleases assays (fx landmåler assay) har fordelen at være relativt hurtigt og let at udføre. Men de har tendens til at være unøjagtig på grund af betydelig baggrund signaler og resultater er ofte vanskelige at formere. De giver desuden ikke oplysninger om kvaliteten af indels genereres (f.eks. længden af indsætninger og sletninger) i eksperimentet. Sanger sekventering giver et værdifuldt alternativ til liv1975 assays. Platforme som TIDEVANDET11 (https://tide.nki.nl/) bidrage til at nedbryde sanger spor og producere nøjagtige skøn over allel forstyrrelser effektivitet, men samtidig også give frekvenserne af individuelle indels. Den store ulempe er en absolutte afhængighed af høj kvalitet Sanger sekventering spor. Høj overførselshastighed amplikon sekventering overvinder de fleste af disse spørgsmål. Amplikon biblioteker kan tilberedes starter med meget lav DNA indgange og en høj dækning sikrer pålidelige resultater. For at reducere omkostningerne ved amplikon sekventering, spike vi normalt i amplikon biblioteker i større sekventering kører (fx RNA-sekventering) ved hjælp af kun 1-1,5% af den samlede læser. Endelig, for at bekræfte vellykket knockout, vi stærkt anbefaler, vurderingen af protein niveauer af western blotting eller flow flowcytometri, når det er muligt.
Som tidligere beskrevet, den metode, der præsenteres her er hurtig og ligetil og repræsenterer et nyt værktøj til at studere gen knock out mus og menneskelige HSPCs. Mens vores protokol indeholder instruktioner for gen knockout med et tip-baserede elektroporation system, har andre systemer vist sig for at være yderst effektiv12,13.
To store begrænsninger skal anerkendes for så vidt angår RNP tilgang. Først, som beskrevet af vores gruppe, levedygtigheden af HSPCs electroporated med in vitro transskriberet sgRNAs kan være betydeligt kompromitteret af elektroporation, især når betingelserne ikke er optimal6. Hvis det er nødvendigt, kan kommercielt syntetiserede sgRNAs (dvs. fjerne in vitro- transskription) afhjælpe dette problem. Disse bliver billigere med tiden og kan købes fra flere leverandører. I dette scenario, in vitro- transskription kan bruges til at generere en pulje af sgRNA til skærmen for effektivitet, og derefter de mest effektive sgRNA(s) kan vælges til syntese. Den anden store begrænsning af RNP tilgang er den manglende evne til at spore med held transfekteret celler, som viral-baserede tilgange. Høj KO effektivitet og hurtig redigering opnås med Cas9-sgRNA RNPs kan dog opveje disse ulemper i mange eksperimentelle scenarier. Vi anbefaler at bruge høj overførselshastighed amplikon sekventering til præcist bestemme forstyrrelser effektivitet i hvert forsøg. Hvis knock-out af gen af interesse forventes at indebære en proliferativ fænotype (dvs. enten reduceret eller forøget spredning i forhold til wild-type celler), fastlæggelse af indel frekvens på flere tidspunkter tillader en at vurdere hvorvidt KO celler gennemgå berigelse (dvs. indel frekvens øges over tid) eller er outcompeted (dvs. indel hyppigheden aftager over tid).
Udførelse af in vivo eller in vitro- eksperimenter for at forstå de biologiske virkninger af tabet af genfunktioner kræver passende kontrol. Som tidligere nævnt, in vitro- transskriberet sgRNAs kan være giftigt for celler, især primære stamfader celler6. Derudover kan DNA dobbelt-strenget pauser forårsaget af Cas9 protein forårsage gen uafhængige anti-proliferativ svar14. Derfor, vi ofte bruger en række kontrol sgRNAs i CRISPR eksperimenter og anbefaler en celle overflade markør udtrykt på din celletype samt en anden target-gen, der ikke er udtrykt.
Kortfristede kultur af human HSPCs i nærværelse af cytokiner øger gen forstyrrelser effektivitet6 og er nødvendige for at opnå høj effektivitet KO. Vi har fundet 36-48 timer for at være den ideelle periode af kultur før elektroporation6. Efter elektroporation, cellerne kan være yderligere kulturperler holde for øje, at jo længere kultur jo højere risiko for at miste multilineage engraftment kapacitet. Derfor, vi normalt udføre transplantationer 6 timer efter elektroporation og aldrig senere end 24 timer efter elektroporation.
CRISPR/Cas9 har dramatisk forbedret mulighed for videnskabsfolk at held Rediger genomet i pattedyrsceller. Gør gen forstyrrelser mere gennemførlig i primære hæmatopoietisk stamceller er forudsagt til at hurtigt forbedre den videnskabelige viden inden for HSPCs og hæmatologiske sygdomme. Vigtigere, gør protokollen beskrevet her det også muligt at samtidig generere flere knockouts med høj effektivitet, gør det muligt for modellering af komplekse genetiske landskaber, ofte ses i leukemic sygdomme.
Selv om de protokoller er beskrevet heri er fokuseret på gen forstyrrelser, kan de være let tilpasses til gen knock-i forsøg. Dette kan opnås gennem fælles levering af enkeltstrenget oligonukleotid skabeloner til homologi-instrueret reparation6,13 (HDR) eller transduktion af celler post-elektroporation med AAV6 vektorer indeholdende den Homologi skabelon12. Evnen til at reparere eller indføre specifikke mutationer i HSPCs vil lette nye terapeutiske strategier for genterapi og en udvidet undersøgelse af kræft driver mutationer i AML og andre hæmatologiske sygdomme. Mens HDR i menneskelige HSPCs har været succesfulde6,12,13, mus HSPCs har været svært at redigere ved hjælp af denne strategi6. Optimering af HDR protokoller i menneskerettighederne og især i mus HSPCs vil gøre det muligt mere specifikke redigering og udvikling af værktøjer til at spore redigerede celler ved hjælp af endogene tagging.
Endelig er det også forestillede sig, at afbrydelse af mutant gevinst af funktion alleler kunne udgøre en potentiel terapeutisk tilgang til medfødte og erhvervede hæmatopoietisk lidelser. I dette scenario anbefales en DNA-fri tilgang for at undgå mulige integrationer, der kunne fremme transformation. Desuden, den “hit og køre” tilgang reducerer muligheden for uønskede off target effekter. Yderligere indsats er nødvendig for at udvikle specifikke leveringssystemer, der ville åbne nye muligheder for behandling af maligne og ikke-maligne hæmatologiske sygdomme.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af den forebyggelse af kræft og forskning Institut for Texas (RP160283, RP140001 og R1201), Gabrielle’s Angel Foundation for kræftforskning, Edward P. Evans Foundation og NIH (DK092883, CA183252, CA125123, P50CA126752, CA193235, og DK107413). M.C.G. er støttet af Baylor forskning fortalere for studerende forskere. Flowcytometri blev delvist støttet af NIH (National Center for Research ressourcer grant S10RR024574, National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme AI036211 og National Cancer Institute P30CA125123) for Baylor College of Medicine Flowcytometri og celle sortering kerne.
Tissue culture plates according to cell numbers | |||
1.5 ml Eppendorf microtubes | Sigma | Z606340-1000EA | |
50ml Falcon tubes | Corning | 352070 | |
Nuclease Free Water – DEPC treated | ThermoFisher Scientific | AM9915G | |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2600 | |
MinElute PCR purification Kit | Qiagen | 28004 | |
RNAse Zap RNAse Decontamination Solution | ThermoFisher Scientific | AM9780 | |
RNA Clean and Concentrator-25 | Zymo | R1017 | |
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 100 µg | IDT | 1074181 | |
40 mm Cell Strainers | VWR | 352340 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | GenDEPOT | CA008-050 | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Regular | Corning | 35010CV | |
AutoMACS Pro Separator or MACS manual Cell Separation columns | Miltenyi | ||
Neon Transfection System Device | ThermoFisher Scientific | ||
Neon Transfection System 10mL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | For larger numbers of cells (see protocol) Neon Transfection System 100 mL kit (# MPK10025) can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575020 | For human experiments only |
Lymphoprep | Stem Cell Technologies | 7851 | For human experiments only |
CD34 MicroBead Kit UltraPure human | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | For human experiments only |
Stem Span SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | For human experiments only |
Recombinant Human SCF | Miltenyi Biotec | 130-096-695 | For human experiments only |
Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | For human experiments only |
Recombinant Human FLT3L | Miltenyi Biotec | 130-096-479 | For human experiments only |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mouse dissection tools | For mouse experiments only | ||
Mortar and Pestle | For mouse experiments only | ||
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170112 | For mouse experiments only |
Biotin-conjugated anti c-kit antibody | eBioscience | 13-1171-82 | For mouse experiments only |
Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | For mouse experiments only |
X VIVO-15, with L-Glutamine, Genatmycin and Phenol Red | Lonza | 04-418Q | For mouse experiments only |
Mouse IL-6 | Peprotech | 216-16 | For mouse experiments only |
Mouse TPO | Peprotech | 315-14 | For mouse experiments only |
Mouse IL-3 | Peprotech | 213-13 | For mouse experiments only |
Mouse SCF | Peprotech | 250-03 | For mouse experiments only |