Plasticitet i nukleära arkitekturen styrs av dynamiska epigenetiska mekanismer, inklusive icke-kodande RNAs, DNA metylering, nukleosomens ompositionering och Histon sammansättning samt modifiering. Här beskriver vi en Formaldehyde-Assisted isolering av reglerande element (FAIRE) protokoll som möjliggör bestämning av kromatin tillgänglighet i en reproducerbar, Billigt och enkelt sätt.
Lämpliga genuttryck som svar på extracellulära signaler, det vill säga vävnad – och härstamning-specifika gentranskription, är kritiskt beroende av mycket definierade påstår av kromatin organisation. Den dynamiska arkitekturen av kärnan styrs av flera mekanismer och formar de transkriptionell utdata program. Det är därför viktigt att bestämma locus-specifika kromatin tillgänglighet i en tillförlitlig mode som är helst oberoende av antikroppar, som kan vara en potentiellt störande källa av experimentella variabilitet. Kromatin tillgänglighet kan mätas med olika metoder, inklusive Formaldehyde-Assisted isolering av reglerande element (FAIRE) analysen, som tillåter bestämning av allmänna kromatin tillgänglighet i ett relativt lågt antal celler. Här beskriver vi ett FAIRE protokoll som tillåter enkel, pålitlig och snabb identifiering av genomisk regioner med en låg protein beläggning. I denna metod, är DNA kovalent bunden till kromatin proteinerna med formaldehyd som en crosslinking agent och klippt i små bitar. Gratis DNA är efteråt berikad med fenol: kloroform extraktion. Förhållandet mellan gratis DNA bestäms av kvantitativa polymeras-kedjereaktion (qPCR) eller DNA-sekvensering (DNA-seq) jämfört med ett urval som representerar totala DNA. Regioner med en lösare kromatinstruktur är berikad med gratis DNA-provet, vilket möjliggör identifiering av genomisk regioner med lägre kromatin packning.
Genomiskt DNA eukaryota celler är tätt packade i nucleosomes, som måste tas bort eller ombyggda för att möjliggöra samverkan mellan andra proteiner och DNA. Transkriptionell aktiveringen av en gen leder vanligtvis till en mer öppen konfigurationen av nucleosomal struktur, särskilt i + 1 nukleosomens1, för att underlätta transkription av RNA-polymeras. Regulatoriska regioner som initiativtagare och smakförstärkare genomgår också, dynamiska förändringar i kromatin tillgänglighet till tillåta interaktion med kromatin modifierare eller transkription faktorer2. Flera metoder har utvecklats för att identifiera dessa nukleosomens-fria regioner. Dessa inkluderar känsligheten för nukleaser såsom DNAS jag3 eller micrococcal nuclease4, som kan endast komma åt DNA när det inte är tätt lindade runt nucleosomes. Andra metoder för identifiering av öppna kromatin eller gratis DNA inkluderar transposase-medierad integrationen av retrotransposable element (test för Transposase-tillgänglig kromatin, ATAC)5eller kromatin immunoprecipitation (ChIP) med antikroppar mot histoner. Metoden FAIRE bygger inte på ett enzym kapacitet att nå DNA eller bindningen av en antikropp till ett särskilt protein, utan istället förlitar sig på rening av nukleosomens-fria regioner av en fenol: kloroform utvinning6,7. I denna metod, DNA är kovalent bunden till kromatin proteiner av crosslinking agent formaldehyd och är klippt därefter små bitar av ultraljudsbehandling. Tätt packade kromatin regioner kommer har riklig DNA och protein antipyridinantikropp, medan DNA regioner med inga eller få nucleosomes har liten eller ingen tvärbundna DNA och protein komplex. En fenol: kloroform utvinning möjliggör rening av den icke-tvärbunden gratis DNA i vattenfasen, medan de DNA tvärbunden till proteiner fångas i den organiska fenol fasen eller vattenlösning-ekologiska interphase tillsammans med proteinerna. Kvantifiering av denna gratis DNA jämfört med en referens av totala DNA-prov möjliggör identifiering av Regionkommittén kromatin gratis. FAIRE metoden kan användas för karakterisering av enskilda genomisk regioner som beskrivs här, men är också lämplig för identifiering av genome-wide kromatin tillgänglighet då den kopplas till djupsekvensering som beskrivs i olika modeller8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. resultaten FAIRE-seq och andra metoder såsom ATAC-seq till stor del överlappar14. Metoden FAIRE är en mycket robust, Billigt och enkelt att utföra metod för att identifiera nukleosomens-fria regioner. Till skillnad från andra metoder, det kräver inte pilot experiment för att fastställa den lämpliga nivån för matsmältningen som krävs för nukleaser (DNAS-seq, MNase-seq) eller transposases (ATAC-seq) och diskuteras i detalj i en senare granskning15. De enda parametrarna justeras är ultraljudsbehandling villkor och i vissa fall tidpunkten för fixering. Detta dokument beskriver ett enkelt protokoll som schematiskt visas i figur 1 och som inte kräver någon särskild utrustning än en någon sonikator. Protokollet kan utföras i en rimligt kort tid och gör FAIRE en enkel och pålitlig metod att testa kromatin tillgänglighet i ett antal olika celltyper som sträcker sig från lungan celler11 till primära celler från mus lever16.
FAIRE är en robust och billig metod som möjliggör identifiering av nukleosomens-fria regioner. Den är baserad på principen att DNA lindad runt nucleosomes enkelt kan vara tvärbunden att Histonerna. En fenol: kloroform utvinning används för att avgränsa icke-tvärbundna och protein-gratis DNA-fragment från proteinbundet DNA, som finns i den lägsta fenol-fasen och i viss utsträckning i interphasen (figur 1). Därför, de nukleosomens-fria regionerna är överrepresenterade i fraktionen av gratis DNA i vattenfasen. Ett antal publikationer beskriver detaljerat protokoll av FAIRE metod23,24,25,26, som kan konsulteras som komplement till det förfarande som beskrivs här.
Liknar andra metoder som används för att bestämma kromatinstrukturen, FAIRE metoden också kritiskt beror på optimal klippning av DNA. Om fragment är för lång, kommer någon nukleosomens-fri region att maskeras av intilliggande kromatin-bundna DNA. Om fragment är för små, blir detektion av qPCR eller djupsekvensering mycket svårt. Av denna anledning, ultraljudsbehandling av DNA är en avgörande parameter som måste kontrolleras och optimeras för att erhålla fragment runt 200-300 bp längd, som utgör 1-2 nucleosomes (figur 4).
En annan parameter som kan påverka det slutliga resultatet är tvärbindning av provet. Även om fixering proceduren som beskrivs här gäller för de flesta cellinjer, forskaren noggrant måste utvärdera detta steg för det särskilda provet under studien, särskilt när användande vävnader, där längre fixering gånger kan vara nödvändigt att tillåta de formaldehyd att nå cellerna i alla vävnadsprov.
Till skillnad från andra metoder, såsom DNAS jag eller micrococcal nuclease överkänslighet, ChIP eller ATAC, FAIRE förlitar sig inte på en enzymatisk aktivitet eller specifika antikroppar och därför behöver det inte titrering eller optimering av reaktion villkor. Detta gör FAIRE idealisk metod att mäta kromatin tillgänglighet för labs med liten erfarenhet i fältet kromatin. Dessutom pilotförsök krävs endast för att optimera steget DNA klippning och crosslinking tid, när det behövs.
Metoden utvecklades ursprungligen i jäst6, men det har också utvidgats till däggdjursceller. DNA renas med FAIRE-metoden kan användas för djupsekvensering, vilket gör genome-wide karakterisering av kromatin status. Detta har redan visat sig vara användbart i ett antal studier8,9,10,11,12,13,19,27, 28.
Resultat från FAIRE-seq experiment visar en stor överlappning med resultaten av andra metoder såsom DNAS-seq14, även om vissa skillnader uppstå. Detta är på grund av metodologiska skillnader som for example avslappnad eller ombyggda nucleosomes kan fortfarande hindra klyvning av DNAS jag, medan dessa DNA-regioner skulle vara mindre benägna att producera DNA och protein antipyridinantikropp och således skulle fastställas som nukleosomens-gratis regioner med FAIRE9. Även förekomsten av icke-histonglykoprotein proteiner såsom RNA polymeraser eller läsaren proteiner för epigenetiska märken kan resultera i DNA och protein antipyridinantikropp och således skulle tolkas som protein-packade regioner i FAIRE experiment. Dessa begränsningar är förbundna med varje metod som används för bestämning av kromatin staten, vilket gör att behovet av att använda en kombination av olika metoder för att få en fullständig inblick.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Tilman Borggrefe (universitetet i Giessen) vänligen dela enhetens ultraljudsbehandling. Arbetet från M.L.S. stöds med bidrag från den Deutsche Forschungsgemeinschafts (SCHM 1417/8-3), SFB/TRR81, SFB1021, SFB1213, Excellence kluster Cardio-Pulmonary systemet (ECCPS, EXC 147/2), den Deutsche Krebshilfe (111447) och IMPRS-HLR programmet för Maximal-Planck Society.
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Carl Roth | A156.1 | |
Glycogen, 20 mg/ml | Thermo Fisher | R0561 | |
ABsolute QPCR Mix, SYBR-Green, Rox | Thermo Fisher | AB1162B | |
Proteinase K, 20 mg/ml | Thermo Fisher | EO0491 | |
RNase A, 10 mg/ml | Thermo Fisher | EN0531 | |
Leupeptin | Sigma | L8511 | |
Aprotinin | Sigma | A1603 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | 78830 | |
milliTUBE 1 ml AFA Fiber | Covaris | 520130 | |
Holder milliTUBE 1ml | Covaris | 500371 | |
Covaris S220 Focused-ultrasonicator | Covaris | ||
StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosistems | 4376600 |