Plasticitet af nukleare arkitektur styres af dynamiske epigenetiske mekanismer, herunder ikke-kodende RNA’er, DNA methylering, nucleosome repositionering samt Histon sammensætning og modifikation. Her beskriver vi en Formaldehyde-Assisted Isolation af regulerende elementer (FAIRE) protokol, som giver bestemmelsen af kromatin tilgængelighed i en reproducerbar, billig og ligetil måde.
Passende genekspression i svar til ekstracellulære stikord, dvs væv og afstamning specifikke gen transskription, afhænger kritisk højt definerede stater af kromatin organisation. Den dynamiske arkitektur af kernen styres af flere mekanismer og figurer transcriptional output programmer. Det er derfor vigtigt at fastlægge locus-specifikke kromatin tilgængelighed på en pålidelig måde, der helst uafhængigt af antistoffer, som kan være et potentielt forstyrrende kilde til eksperimentel variation. Kromatin tilgængelighed kan måles ved forskellige metoder, herunder Formaldehyde-Assisted Isolation af regulerende elementer (FAIRE) assay, der kunne give generelle kromatin tilgængelighed i et relativt lavt antal celler. Her beskriver vi en FAIRE protokol, der giver mulighed for enkel, pålidelig og hurtig identifikation af genomisk regioner med et lavt protein belægning. I denne metode, er DNA kovalent bundet til kromatin proteiner ved hjælp af formaldehyd som en crosslinking agent og klippet i små stykker. Gratis DNA er bagefter beriget ved hjælp af phenol: chloroform udvinding. Forholdet mellem gratis DNA bestemmes af kvantitative Polymerasekædereaktionen (qPCR) eller DNA-sekventering (DNA-FF.) i forhold til en kontrolprøve, der repræsenterer samlede DNA. Regioner med en løsere kromatin struktur er beriget med gratis DNA-prøven, således at identifikation af genomisk regioner med lavere kromatin jordpakning.
Genomisk DNA af eukaryote celler er tæt pakket ind i nucleosomes, som skal fjernes eller ombygget for at tillade interaktion med andre proteiner med DNA. Transkriptionel aktivering af et gen typisk fører til en mere åben konfiguration af sin nucleosomal struktur, især i + 1 nucleosome1, lette transskription af RNA polymerase. Reguleringsmæssige områder som initiativtagere og smagsforstærkere undergår også, dynamiske ændringer i deres kromatin tilgængelighed til at tillade interaktion med kromatin modifikatorer eller transskription faktorer2. Flere metoder er blevet udviklet for at identificere disse nucleosome-frie regioner. Disse omfatter følsomhed til nukleaser såsom DNase jeg3 eller micrococcal nukleasen4, som har kun adgang til DNA, når det ikke er stramt svøbt omkring nucleosomes. Andre metoder til identifikation af åbne kromatin eller gratis DNA omfatter en transposase-medieret integration af retrotransposable elementer (Assay for Transposase-tilgængelige kromatin, ATAC)5, eller kromatin immunoprecipitation (ChIP) ved hjælp af antistoffer mod histoner. Metoden FAIRE er ikke baseret på et enzym kapacitet til at nå DNA eller binding af et antistof mod et bestemt protein, men i stedet bygger på rensning af nucleosome-frie regioner af phenol: chloroform udvinding6,7. I denne metode, DNA er kovalent bundet til kromatin proteiner af crosslinking agent formaldehyd og er forskydes bagefter i små stykker ved hjælp af sonikering. Tætpakkede kromatin regioner vil have rigelige DNA/protein krydsbindinger, mens DNA regioner med ingen eller kun få nucleosomes vil have ringe eller ingen crosslinked DNA/protein komplekser. En phenol: chloroform udvinding giver mulighed for rensning af den ikke-crosslinked gratis DNA i den vandige fase, mens DNA crosslinked at proteiner er fanget i økologisk phenol fase eller vandig-økologisk interfase med proteiner. Kvantificering af denne gratis DNA i forhold til en reference af samlede DNA-prøve giver mulighed for identifikation af kromatin gratis regioner. FAIRE metode kan anvendes til karakterisering af genomisk enkeltregioner, som beskrevet her, men er også velegnet til identifikation af genome-wide kromatin tilgængelighed når koblet til dyb sekventering, som beskrevet i forskellige modeller8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. resultaterne af FAIRE-FF. og andre metoder såsom ATAC-seq er stort set overlappende14. FAIRE-metoden er en meget robust, billige og nemme at udføre metode til at identificere nucleosome-frie regioner. I modsætning til andre metoder, det kræver ikke pilot forsøg for at bestemme det relevante niveau for fordøjelsen som krævet for nukleaser (DNase-FF., MNase-seq) eller transposases (ATAC-seq) og drøftet i detaljer i en nylig revision15. De eneste parametre skal justeres er sonikering betingelser og i nogle tilfælde fiksering tid. Dette papir beskriver en enkel protokol der vises skematisk i figur 1 og som ikke kræver nogen særligt udstyr end en sonikator. Protokollen kan udføres i en rimelig kort tid og gør FAIRE en nem og pålidelig metode til at teste kromatin tilgængelighed i en række forskellige celletyper spænder fra lunge celler11 til primærelementer fremstillet af mus lever16.
FAIRE er en robust og billig metode til identifikation af nucleosome-frie regioner. Det er baseret på princippet om, at DNA snoet omkring nucleosomes nemt kan crosslinked til histonerne. En phenol: chloroform udvinding bruges til at adskille ikke-crosslinked og protein-gratis DNA fragmenter fra protein-bundne DNA, som er fundet i den lavere phenol fase og til en vis grad i interfase (figur 1). Derfor, de nucleosome-frie regioner er overrepræsenteret i brøkdel af gratis DNA i den vandige fase. En række publikationer beskrive detaljerede protokoller af FAIRE metode23,24,25,26, som kan høres for at supplere proceduren beskrevet her.
I lighed med andre metoder, der anvendes til at bestemme strukturen kromatin, metoden FAIRE også kritisk afhænger af optimal klipning af DNA. Hvis fragmenter er for lange, vil nogen nucleosome-fri region blive maskeret af tilstødende kromatin-bundne DNA. Hvis fragmenter er for små, bliver detektering af qPCR eller dyb sekventering meget vanskeligt. Af denne grund, ultralydbehandling af DNA er en afgørende parameter, der skal kontrolleres og optimeret for at opnå fragmenter omkring 200-300 bp længde, der udgør 1-2 nucleosomes (figur 4).
En anden parameter, der kan påvirke det endelige resultat er crosslinking af prøven. Selv om fiksering proceduren beskrevet her er gyldig for de fleste cellelinjer, forskeren omhyggeligt skal evaluere dette trin for den bestemte prøve under undersøgelsen, især når du bruger væv, hvor længere optagelse gange kan være nødvendigt at tillade de formaldehyd til nå celler i alle vævsprøve.
I modsætning til andre metoder, såsom DNase jeg eller micrococcal nukleasen overfølsomhed, ChIP eller ATAC, FAIRE ikke stole på en enzymatisk aktivitet eller specifikke antistoffer, og det behøver derfor ikke titrering eller optimering af reaktionsbetingelser. Dette gør FAIRE en ideel metode til at måle kromatin tilgængelighed for labs med lidt erfaring i feltet kromatin. Desuden pilotforsøg er kun behov for at optimere DNA klipning trin og crosslinking tid, når det er nødvendigt.
Metoden blev oprindeligt udviklet i gær6, men det er også blevet udvidet til pattedyrsceller. DNA renset med metoden FAIRE kan bruges til dybe sekvensering, så genome-wide karakterisering af kromatin status. Det har allerede vist sig nyttig i en række undersøgelser8,9,10,11,12,13,19,27, 28.
Resultaterne fra FAIRE-seq eksperimenter viser et stort overlap med resultaterne af andre metoder såsom DNase-seq14, selv om nogle forskelle opstår. Dette er på grund af metodologiske forskelle som for eksempel afslappet eller ombygget nucleosomes kunne stadig hindrer spaltning af DNase jeg, mens disse DNA regioner ville være mindre tilbøjelige til at producere DNA/protein krydsbindinger og dermed ville blive bestemt som nucleosome-fri områder ved hjælp af FAIRE9. Også tilstedeværelsen af ikke-Histon proteiner såsom RNA polymeraser eller læser proteiner for epigenetiske mærker kunne resultere i DNA/protein krydsbindinger og dermed ville blive tolket som protein-pakket regioner i FAIRE eksperimenter. Disse begrænsninger er forbundet til hver metode anvendes til bestemmelse af kromatin stat, således at øge behovet for at bruge en kombination af forskellige metoder til at opnå en omfattende indsigt.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Tilman Borggrefe (universitetet i Giessen) for venligt deling sonikering enhed. Arbejde fra M.L.S. understøttes af tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (SCHM 1417/8-3), SFB/TRR81, SFB1021, SFB1213, Excellence klynge Cardio-pulmonal System (ECCPS, EXC 147/2), Deutsche Krebshilfe (111447) og programmet IMPRS-HLR af Max-Planck selskabet.
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Carl Roth | A156.1 | |
Glycogen, 20 mg/ml | Thermo Fisher | R0561 | |
ABsolute QPCR Mix, SYBR-Green, Rox | Thermo Fisher | AB1162B | |
Proteinase K, 20 mg/ml | Thermo Fisher | EO0491 | |
RNase A, 10 mg/ml | Thermo Fisher | EN0531 | |
Leupeptin | Sigma | L8511 | |
Aprotinin | Sigma | A1603 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | 78830 | |
milliTUBE 1 ml AFA Fiber | Covaris | 520130 | |
Holder milliTUBE 1ml | Covaris | 500371 | |
Covaris S220 Focused-ultrasonicator | Covaris | ||
StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosistems | 4376600 |