परमाणु वास्तुकला की प्लास्टिक की गैर कोडिंग RNAs, डीएनए मिथाइल, nucleosome के रूप में के रूप में अच्छी तरह से हिस्टोन संरचना और संशोधन सहित गतिशील epigenetic तंत्र द्वारा नियंत्रित है । यहां हम एक Formaldehyde विनियामक तत्वों (साफ) प्रोटोकॉल जो एक reproducible, सस्ती, और सरल तरीके से क्रोमेटिन पहुंच के निर्धारण की अनुमति देता है की सहायता अलगाव का वर्णन ।
उपयुक्त extracellular cues के जवाब में जीन अभिव्यक्ति, कि है, ऊतक और वंश-विशिष्ट जीन प्रतिलेखन, गंभीर क्रोमेटिन संगठन के उच्च परिभाषित राज्यों पर निर्भर करता है । नाभिक के गतिशील वास्तुकला कई तंत्र द्वारा नियंत्रित और transcriptional उत्पादन कार्यक्रम आकार है । इसलिए, एक विश्वसनीय फैशन है कि अधिमानतः एंटीबॉडी, जो प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता का एक संभावित स्रोत हो सकता है से स्वतंत्र है में लोकस विशिष्ट क्रोमेटिन पहुंच निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है । क्रोमेटिन पहुंच विभिंन तरीकों से मापा जा सकता है, विनियामक तत्वों के Formaldehyde-असिस्टेड अलगाव (निष्पक्ष) परख, कि कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत कम संख्या में सामांय क्रोमेटिन पहुंच के निर्धारण की अनुमति सहित । यहां हम एक निष्पक्ष प्रोटोकॉल है कि एक कम प्रोटीन अधिभोग के साथ सरल, विश्वसनीय, और जीनोमिक क्षेत्रों की तेजी से पहचान की अनुमति देता है का वर्णन । इस विधि में, डीएनए एक crosslinking एजेंट के रूप में formaldehyde का उपयोग कर क्रोमेटिन प्रोटीन के लिए बाध्य covalently और छोटे टुकड़े करने के लिए कतरनी है । मुक्त डीएनए बाद में phenol का उपयोग कर समृद्ध है: क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण । नि: शुल्क डीएनए के अनुपात मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) या डीएनए sequencing कुल डीएनए का प्रतिनिधित्व करने वाले एक नियंत्रण नमूने की तुलना में (डीएनए seq) द्वारा निर्धारित किया जाता है । एक पराजित क्रोमेटिन संरचना के साथ क्षेत्रों मुक्त डीएनए नमूने में समृद्ध कर रहे हैं, इस प्रकार कम क्रोमेटिन संकुचन के साथ जीनोमिक क्षेत्रों की पहचान की अनुमति ।
eukaryotic कोशिकाओं के जीनोमिक डीएनए कसकर nucleosomes में पैक किया जाता है, जो हटा दिया या आदेश में डीएनए के साथ अन्य प्रोटीन की बातचीत की अनुमति के लिए remodeled करने की जरूरत है. एक जीन के transcriptional सक्रियण आमतौर पर अपनी nucleosomal संरचना का एक और अधिक खुला विन्यास की ओर जाता है, विशेष रूप से + 1 nucleosome1में, आरएनए पोलीमरेज़ द्वारा प्रतिलेखन की सुविधा के लिए. इसके अलावा, प्रवर्तकों और बढ़ाने के रूप में विनियामक क्षेत्र क्रोमेटिन संशोधक या प्रतिलेखन कारकों के साथ बातचीत की अनुमति देने के लिए अपने क्रोमेटिन पहुंच में गतिशील परिवर्तन से गुजरना2। इन nucleosome-मुक्त क्षेत्रों की पहचान करने के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं । इनमें DNase I3 या micrococcal nuclease4जैसे nucleases के प्रति संवेदनशीलता शामिल है, जो nucleosomes के आसपास कसकर लिपटी न होने पर ही डीएनए का उपयोग कर सकती है । ओपन क्रोमेटिन या मुफ्त डीएनए की पहचान के लिए अंय तरीकों में शामिल है transposase-retrotransposable तत्वों की मध्यस्थता एकीकरण (transposase के लिए परख-सुलभ क्रोमेटिन, ATAC)5, या क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) का उपयोग histones के खिलाफ एंटीबॉडी । निष्पक्ष विधि एक एंजाइम की क्षमता पर आधारित नहीं है डीएनए या एक विशेष प्रोटीन के लिए एक एंटीबॉडी के बंधन तक पहुंचने के लिए, लेकिन इसके बजाय एक phenol द्वारा nucleosome मुक्त क्षेत्रों की शुद्धि पर निर्भर करता है: क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण6,7। इस विधि में, डीएनए crosslinking एजेंट formaldehyde द्वारा क्रोमेटिन प्रोटीन के लिए बाध्य covalently है और बाद में sonication द्वारा छोटे टुकड़े करने के लिए कतरनी है । कसकर पैक्ड क्रोमेटिन क्षेत्रों में प्रचुर मात्रा में डीएनए होगा/प्रोटीन crosslinks, जबकि कोई या कुछ nucleosomes के साथ डीएनए क्षेत्रों कम या कोई crosslinked डीएनए/ एक phenol: क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण जलीय चरण में गैर crosslinked मुक्त डीएनए की शुद्धि की अनुमति देता है, जबकि डीएनए crosslinked प्रोटीन कार्बनिक phenol चरण या जलीय-कार्बनिक चरण में एक साथ प्रोटीन के साथ कब्जा कर लिया है । कुल डीएनए नमूने के एक संदर्भ की तुलना में इस मुफ्त डीएनए के ठहराव क्रोमेटिन मुक्त क्षेत्रों की पहचान की अनुमति देता है । निष्पक्ष विधि व्यक्तिगत जीनोमिक क्षेत्रों के लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में यहां वर्णित है, लेकिन भी जीनोम चौड़ा क्रोमेटिन पहुंच की पहचान के लिए उपयुक्त है जब गहरे अनुक्रमण के लिए युग्मित के रूप में विभिंन मॉडलों में वर्णित है8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. मेलों द्वारा प्राप्त परिणाम-seq और अंय तरीकों जैसे ATAC-seq मोटे तौर पर14अतिव्यापी हैं । निष्पक्ष विधि एक बहुत मजबूत, सस्ते, और nucleosome मुक्त क्षेत्रों की पहचान करने के लिए विधि करने के लिए आसान है । अन्य तरीकों के विपरीत, यह nucleases के लिए आवश्यक के रूप में पाचन के उचित स्तर का निर्धारण करने के लिए पायलट प्रयोगों की आवश्यकता नहीं है (DNase-seq, MNase-seq) या transposases (ATAC-seq) और एक हाल की समीक्षा में विस्तार से चर्चा की15. केवल पैरामीटर समायोजित किया जा करने के लिए sonication शर्तों और कुछ मामलों में निर्धारण समय है । यह कागज एक सीधा प्रोटोकॉल है कि योजनाबद्ध रूप से चित्रा 1 में प्रदर्शित किया जाता है का वर्णन करता है और यह है कि किसी भी विशेष एक sonicator के अलावा अन्य उपकरणों की आवश्यकता नहीं है । प्रोटोकॉल एक यथोचित कम समय में प्रदर्शन किया जा सकता है और एक आसान और विश्वसनीय विधि के लिए विभिंन प्रकार के सेल के एक नंबर में क्रोमेटिन पहुंच परीक्षण फेफड़ों कोशिकाओं11 से प्राथमिक कोशिकाओं माउस जिगर से प्राप्त करने के लिए16।
मेलों एक मजबूत और सस्ती nucleosome-मुक्त क्षेत्रों की पहचान की अनुमति विधि है । यह सिद्धांत पर आधारित है कि nucleosomes के आसपास डीएनए लिपटे आसानी से histones को crosslinked जा सकता है । एक phenol: क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण को प्रोटीन से बंधे डीएनए से गैर-crosslinked और प्रोटीन रहित डीएनए अंशों को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जो निचले phenol चरण में और कुछ हद तक (चित्र 1) में पाया जाता है । इसलिए, nucleosome मुक्त क्षेत्रों जलीय चरण में मुफ्त डीएनए के अंश में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । प्रकाशनों के एक नंबर मेला विधि23,24,25,26है, जो यहां वर्णित प्रक्रिया पूरक करने के लिए परामर्श किया जा सकता है की विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन ।
अंय क्रोमेटिन संरचना निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों के समान, निष्पक्ष विधि भी गंभीर डीएनए के इष्टतम कतरनी पर निर्भर करता है । यदि टुकड़े बहुत लंबे हैं, तो किसी भी nucleosome-मुक्त क्षेत्र आसन्न क्रोमेटिन-बंधे डीएनए द्वारा नकाबपोश हो जाएगा । यदि टुकड़े बहुत छोटे हैं, qPCR या गहरी अनुक्रमण द्वारा पता लगाना बहुत मुश्किल हो जाता है । इस कारण से, sonication के डीएनए के एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है कि नियंत्रित किया जाना चाहिए और अनुकूलित करने के लिए चारों ओर टुकड़े प्राप्त करने के लिए 200-300 बीपी लंबाई, जो 1-2 nucleosomes(चित्रा 4) का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
एक अंय पैरामीटर है कि अंतिम परिणाम को प्रभावित कर सकते है नमूना के crosslinking है । हालांकि निर्धारण की प्रक्रिया यहां वर्णित सबसे सेल लाइनों के लिए मांय है, शोधकर्ता ध्यान से अध्ययन के तहत विशेष रूप से नमूने के लिए इस कदम का मूल्यांकन करना चाहिए, खासकर जब ऊतकों, जहां अब निर्धारण समय की अनुमति के लिए आवश्यक हो सकता है का उपयोग कर formaldehyde सभी ऊतक नमूने में कोशिकाओं तक पहुंचने के लिए ।
ऐसी DNase मैं या micrococcal nuclease अतिसंवेदनशीलता, चिप, या ATAC के रूप में अंय तरीकों के विपरीत, मुंहासे एक एंजाइमी गतिविधि या विशिष्ट एंटीबॉडी पर भरोसा नहीं है, और इसलिए यह अनुमापन या प्रतिक्रिया शर्तों के अनुकूलन की जरूरत नहीं है । यह क्रोमेटिन क्षेत्र में थोड़ा अनुभव के साथ प्रयोगशालाओं के लिए क्रोमेटिन पहुंच को मापने के लिए एक आदर्श पद्धति को साफ करता है । इसके अलावा, पायलट प्रयोगों केवल आदेश में डीएनए कतरनी कदम और crosslinking समय, जब आवश्यक अनुकूलित करने के लिए आवश्यक हैं ।
विधि शुरू में खमीर6में विकसित किया गया था, लेकिन यह भी स्तनधारी कोशिकाओं को बढ़ाया गया है । निष्पक्ष विधि के साथ शुद्ध डीएनए गहरी अनुक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, क्रोमेटिन स्थिति के जीनोम चौड़ा लक्षण वर्णन की अनुमति । यह पहले से ही कई अध्ययनों में उपयोगी साबित हो गया है8,9,10,11,12,13,19,27, 28.
निष्पक्ष-seq प्रयोगों से परिणाम DNase I-seq14जैसे अंय पद्धतियों द्वारा प्राप्त परिणामों के साथ एक बड़ा ओवरलैप दिखाते हैं, हालांकि कुछ अंतर पैदा होते हैं । इस उदाहरण के लिए के रूप में methodological मतभेद के कारण है आराम या remodeled nucleosomes अभी भी DNase द्वारा दरार बाधा सकता है मैं, जबकि इन डीएनए क्षेत्रों कम डीएनए का उत्पादन करने के लिए प्रवण होगा/प्रोटीन crosslinks और इस प्रकार nucleosome के रूप में निर्धारित किया जाएगा मुक्त संपल्यानंतर९का उपयोग करते हुए क्षेत्र. इसके अलावा, गैर हिस्टोन प्रोटीन की उपस्थिति ऐसी आरएनए polymerases या epigenetic के निशान के लिए पाठक प्रोटीन के रूप में डीएनए/प्रोटीन crosslinks में परिणाम सकता है और इस तरह परियों प्रयोगों में प्रोटीन पैक क्षेत्रों के रूप में व्याख्या की जाएगी । इन सीमाओं हर विधि क्रोमेटिन राज्य के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया, इस प्रकार के लिए विभिंन तरीकों का एक संयोजन का उपयोग करने के लिए एक व्यापक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने की आवश्यकता स्थापना के लिए अंतर्निहित हैं ।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों टिलमैन Borggrefe (Giessen के विश्वविद्यालय) कृपया sonication डिवाइस साझा करने के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । M.L.S. से काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (SCHM 1417/8-3), SFB/TRR81, SFB1021, SFB1213, उत्कृष्टता क्लस्टर कार्डियो-पल्मोनरी सिस्टम (ECCPS, EXC 147/2), ड्यूश Krebshilfe (१११४४७) और IMPRS-HLR कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित है मैक्स-प्लैंक सोसायटी की ।
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Carl Roth | A156.1 | |
Glycogen, 20 mg/ml | Thermo Fisher | R0561 | |
ABsolute QPCR Mix, SYBR-Green, Rox | Thermo Fisher | AB1162B | |
Proteinase K, 20 mg/ml | Thermo Fisher | EO0491 | |
RNase A, 10 mg/ml | Thermo Fisher | EN0531 | |
Leupeptin | Sigma | L8511 | |
Aprotinin | Sigma | A1603 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | 78830 | |
milliTUBE 1 ml AFA Fiber | Covaris | 520130 | |
Holder milliTUBE 1ml | Covaris | 500371 | |
Covaris S220 Focused-ultrasonicator | Covaris | ||
StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosistems | 4376600 |