JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
면역학 및 감염병학

Electrochemiluminescence deneyleri için insan adacık otoantikorlar

Published: March 23, 2018
doi:
10.3791/57227
, , , , ,
1Barbara Davis Center for Childhood Diabetes,University of Colorado Denver, 2Department of Endocrinology,First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University

Summary

Burada, biz electrochemiluminescence (ECL) deneyleri kullanarak insan adacık otoantikorlar algılamak için yöntemler sundu. Tip 1 diyabet, tahmin etmek için kullanılan iletişim kuralı, üzerine otoantikorlar diğer otoimmün hastalıklar için algılamak için genişletilebilir.

Abstract

Tip 1 diyabet ile ilişkili adacık otoantikorlar saptayarak (T1D) projesi ve bu hastalığın genel popülasyonda caydırmak için yol açar. Bir roman ECL tahlil için adacık otoantikorlar ile daha yüksek duyarlılık ve özgüllük geçerli ‘altın’ standart radyo-bağlama tahlil (RBA) daha nonradioactive sıvı faz tahlil olduğunu. ECL deneyleri daha doğrusu RBAs ve geleneksel enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISA içinde oluşturulan düşük riskli, düşük-benzeşme otoantikorlar üzerinden yüksek risk, yüksek-benzeşme otoantikorlar ayırt presymptomatic T1D başlangıçlı tanımlayabilirsiniz ). Bu ECL assay olarak kullanılan antijen protein Sulfo etiketi ve Biotin, anılan sıraya göre etiketlenir. Laboratuvar uygulaması için kullanılmadan önce belirli antijen protein kullanan her ECL antikor tahlil bir optimizasyon adım gerekir. Bu adım özellikle serum asit tedavisi, konsantrasyonları ve oranları ile Sulfo-etiket ve Biotin etiketli iki farklı antijenleri gereksinimlerini belirlemede önemlidir. Tahlil gerçekleştirmek için antijen protein tamponlanmış fosfat çözüm (PBS), % 5 içeren serum örnekleri ile karışık Sulfo etiket Birleşik ve biotinylated yakalama sığır Serum Albumin (BSA). Daha sonra örnekleri gecede 4 ° C’de inkübe Aynı gün streptavidin kaplı bir plaka ile pencere engelleyicisi tampon hazırlanır ve gecede 4 ° C’de inkübe İkinci gününde streptavidin tabak yıkama ve serum antijen karışımı plaka üzerine aktarın. Plaka plaka shaker yerleştirin, düşük hızda ayarlayın ve 1 h için oda sıcaklığında kuluçkaya. Daha sonra plaka tekrar yıkadım ve okuyucu arabellek eklenir. Plaka sonra plaka okuyucu makinede sayılır. Sonuçları iç standart pozitif ve negatif kontrol serum örnekleri oluşturulan bir dizin içinde aktarılmaktadır.

Introduction

Son bir hazırlama sınıflandırma sistemi T1D ilk etap hastalarda Tanı ile yardımcı olmak için oluşturuldu. İnsan adacık otoantikorlar tam algılama belirlenmesinde önemli bir rol oynar ve evreleme presymptomatic tip 1 diyabet, adacık otoantikorlar varlığı β-hücre otoimmünite varlığını gösterir gibi. Hangi diyabet β-hücre otoimmünite ilk oluşumunu etkiler hastalar semptomatik hastalık ilişkili adacık otoantikorlar, türü ve numarası ile oranıdır değişken2,3.

Antikor serokonversiyonu, titresi ve adacık otoantikorlar benzeşme semptomatik tip 1 diyabet4,5,6,7,8 ilerleme hızını etkileyebilir ,9,10. Son zamanlarda, Gelişmiş ECL deneyleri kapsamlı bir şekilde doğrulanmış, duyarlılık arttı göstermiştir ve daha fazla hastalığa özgü10,11,12,13vardır. Bu deneyleri tahmin ve evreleme adacık otoantikorlar önceki tespiti ile şeker hastalığı riskini artırır. Daha doğrusu adacık otoimmünite inisiyasyon işaretlemek ve diyabet için alakalı değil düşük-benzeşme ve düşük riskli sinyalleri görmezden geliyor.

ECL assay olarak, otoantikorlar serum, varsa, biotinylated yakalama antijen için Sulfo etiket Birleşik antijen akışkan aşamasında köprü. Köprüleme sonra Biotin bağlayıcı katı aşamasında yakaladı ve ECL streptavidin kaplı plaka (şekil 1) Sulfo etiketinde tarafından algılanan.

Bu derlemede, öncelikle tek antikor ECL deneyleri insan adacık otoantikorlar ile kullanılmaktadır. Kısaca, multiplexed antikor deneyleri tek ECL deneyleri göre tartışılacaktır. Multiplex tahlil birden çok, en çok 10, otoantikorlar içinde bir tek şey, 15 µL serum kullanarak tanımlamak için kullanılabilir. Bu basit yüksek işlem hacmi tahlil perde, aynı anda birden fazla ilgili otoimmün hastalıklar genel popülasyonda için birden fazla otoantikorlar için kullanılabilir.

Protocol

1. arabellek hazırlık Arabellek (2 x PBS, pH 7,9) etiketleme: 400 ml deiyonize distile (DD) su 100 mL 10 x PBS ekleyin, pH 7,9 NaOH ile için ayarlayın. biotin 3 mM: 1 mg biotin arabellek etiketleme 588 µL içinde çözülür. 3 mM Sulfo-etiket: Sulfo-etiket dağıtılması 150 nmol arabellek etiketleme 50 µL içinde. Antijen arabellek (%5 BSA): 500 mL 1 x PBS, 25 g, sığır Serum Albumin (BSA) ekleyin. 0, 5 M Asetik asit çözüm hazırlamak. Tris-HCl tampon pH 9.0 1,0 M: hazırlamak 1 M Tris-HCl tampon ve pH HCl ile 9.0 için ayarlayın. Kaplama arabellek (%3 kütük parçası A): 500 mL 1 x PBS, engelleyici A. 15 g ekleyin Çamaşır arabellek (% 0.05 ara 20, PBST): 5000 mL 1 x PBS, ara 20 2.5 mL ekleyin. Okuma arabelleği (2 okuma arabelleği T ile yüzey aktif x): DD su 500 mL, 500 mL 4 x okuma arabelleği T yüzey aktif (Malzemeler tablo) ile ekleyin. Biotin ve Sulfo-etiket-20 ° C dondurucuda saklayın.Not: Her ikisi de Biotin ve Sulfo-etiket çözümleri her zaman taze hazırlanmış sadece etiketleme yordamı önce. 2. etiket Biotin ve Sulfo-etiketi ile insan adacık Autoantigen Not: Antijen, ≥0.5 mg/mL, yüksek yoğunlukta bir daha verimli etiketleme tepki için önerilir. Biotin ve Sulfo-etiket için insan adacık autoantigen molar oranını belirler. Antijen molar numarası tarafından Moleküler ağırlık antijen ağırlık bölerek elde etmek. Molar oranı 1:5 küçük molekül ağırlıklı (≤10 kd) antijen ve molar oranı 1:20 büyük molekül ağırlığı ile antijen için kullanın (> 50 kd). Birimin Biotin veya Sulfo-etiket için onun konsantrasyon tarafından molar numarası bölünerek hesaplayın. İnsan adacık autoantigen Biotin veya Sulfo-etiketi ile 1:5 molar oranı ile karıştırın.Not: Tris veya glisin tampon sistemleri protein miktarının 2 katı PBS tampon pH boyutlandırma spin kullanarak 7.9 ile alışverişinde sütun. Biotin ve Sulfo-etiket ışığa duyarlı olduğundan, alüminyum folyo ile reaksiyon tüplerin kapak. Reaksiyon, oda sıcaklığında (RT) 1 h için kuluçkaya. Kuluçka sırasında spin sütun tarafından dağıtım 2 x PBS arabellek sütuna üç kez Başbakan. Belgili tanımlık eriyik vasıl 1000 x g 2 dk santrifüj kapasitesi her zaman.Not: Şu anda köprüleme, aracılığıyla etiketleme tepkisi, hala meydana gelen ve durdurulması gerekiyor. Etiketleme tepki etiketli insan adacık autoantigen arındırıcı tarafından durdurmak. Arındırmak için spin sütunu boyunca autoantigen geçmek ve 1000 x g 2 min için adresindeki sütun santrifüj kapasitesi. Antijen protein ve son hacim miktarda kullanarak etiketli antijen konsantrasyonu (µg/µL) belirlemek.Not: Kabaca, orada-ecek var olmak % 90-95 saklama etiketli antijen her spin sütun geçtikten sonra. Aliquot-80 ° C’de etiketli antijen ve mağaza etiketli antijen 3. en iyi konsantrasyonları ve oranları iki etiketli antijenleri için tahlil (ekose desenli kurulu tahlil) tanımlamak İki serum numuneleri, yüksek pozitif bir, her 200 µL toplam hacmi ile negatif ve bir tane hazırlayın. Aliquot 4 µL serum ve son hacim 96-şey PCR plaka için iyi başına 20 µL olana 1 x PBS ekleyin. Bir tabak yarısı yüksek olumlu örnek ve olumsuz örnek için diğer yarısı için şekil 2Agösterildiği gibi kullanın. 10 µL biotin ve Sulfo-etiketi için iki farklı etiketli antijenler antijen ve davranış seri dilutions gösterildiği şekil 2Aetiketli 10 µL ekleyin. Bir etiketli antijen için yatay bir seri seyreltme ve etiketli diğer antijen için dikey bir seri seyreltme çalıştırın. 5.3-9.1 içinde açıklanan tahlil adımları geri kalanı devam. Yüksek olumlu örnek her şekil 2Biçinde gösterilen negatif örnekten karşılık gelen sinyallerin karşı gelen sinyalleri oranını hesaplamak. Biotin için en iyi konsantrasyonları tanımlamak ve bir nokta ile en yüksek veya en yüksek oranı negatif pozitif yakınındaki seçerek antijenleri Sulfo-etiket etiketli. Oranı belirlemek için olumsuz örnek düşük arka plan sinyalini göz önünde bulundurun.Not: Adım 4 adım 6 için tahlil gün 1 içerir. 4. hazırlayın Antigen arabelleği Biotin/Sulfo-tag antijen etiketli doğru konsantrasyon kullanarak Her antijen Denetleyicisi Yönetim Kurulu tahlil üzerinde dayalı rasyonel konsantrasyonu seçin. Antijen çözüm Biotin/Sulfo-tag antijen antijen arabelleği için etiketli rasyonel konsantrasyon kullanarak plaka başına 3 mL hazırlayın. 5. Serum numuneleri etiketli antijen ile kuluçkaya Not: Bu bölümde iki protokol, serum asit tedavisi olmayan kişi ve bir serum asit tedavisi ile vardır. Oysa IAA tahlil adımları atlar ve serum asit tedavisi adımlardan 5.6-5,9 ile iletişim kuralını kullanan tüm adacık antikor deneyleri IAA tahlil dışında adımlardan 5.1-5,5, serum asit tedavi olmadan normal protokol kullanın. Aliquot 4 µL serum ve son hacim 96-şey PCR plaka için iyi başına 20 µL olana 1 x PBS ekleyin. Etiketli antijen çözüm iyi başına 20 µL ekleyin. PCR plaka folyo ışık önlemek için mühürleme ile kapak. Bir shaker (düşük hız) RT, 2s için plaka koymak. 4 ° C buzdolabında plaka koymak ve kuluçkaya geceleme (18-24 h).Not: Aşağıdaki protokol 5.6 adım ile 5,9 sadece IAA tahlil için tasarlanmıştır ve diğer antikor deneyleri bu adımları atlayın. 18 µL serum örnekleri için 0,5 M Asetik asit ile Mix 15 µL serum. RT bu karisimin 45 dk için kuluçkaya. Biotin ve Sulfo-antijen Denetleyicisi Yönetim Kurulu tahlil dayalı, etiketli antijen tampon kullanarak etiket rasyonel konsantrasyon antijen Çözümle hazırlayın. Her iyi, yeni bir PCR plaka antijen, aliquot 35 µL antijen arabelleği, Biotin ve Sulfo-etiketi içeren etiketli. 45 dk kuluçka (Adım 5.6) adım bitmeden önce her şey (Adım 5.6) antijen tabakta tarafına 1 M Tris pH 9.0 arabelleği 8.3 µL ekleyin. Tris tampon ve antijen arasında karıştırma sınırlamak önemlidir. Hemen adım 5.6, her kuyuya asit ile tedavi serum 25 µL aktarmak ve çözüm tahrik. PCR plaka folyo ışık önlemek için mühürleme ile kapak. 2 h. 4 ° C buzdolabında tabak koyun RT bir shaker (düşük hız) plaka koymak ve kuluçkaya için plaka izin geceleme (18-24 h). 6. Streptavidin plaka hazırlayın Streptavidin plaka 4 ° C buzdolabından alın ve plaka RT. için gelmek izin Streptavidin plaka RT olduğunda, her şey için 150 µL % 3 kütük parçası A ekleyin. PCR plaka folyo mühürleme ile kapak. 4 ° C buzdolabında tabak gecede kuluçkaya.Not: Tahlil gün 2 adım 7 adım 9’ye içerir. 7. transfer Serum/antijen Streptavidin plakasına kuluçkaya Ertesi gün, buzdolabı streptavidin plaka çıkarmak ve plaka arabelleğinden atın. Biraz kuru kağıt havlu masayı ve kuyuları içinde daha fazla arabellek yok olana plaka baş aşağı dokunun. PBST 150 µL de başı boş streptavidin plaka doldurmak ve plaka üç yıkama olmak üzere toplam PBST atın. 30 aktarım µL serum/antijen kuluçkaya iyi streptavidin plaka. Işık önlemek için folyo ile plaka kapak. Bir düşük ayarda RT için 1 h, plaka, salla. 8. yıkayayım plaka ve okuma arabelleği ekleyin Atma plaka incubates. PBST 150 µL iyi ücret ekleyin ve plaka üç yıkama olmak üzere toplam PBST atın. Yıkandıktan sonra iyi okuma arabelleği başına 150 µL ekleyin.Not: Bu plaka plaka okuyucu makinede nasıl okurum etkiler çünkü çözüm içinde hava kabarcıkları önlemek önemlidir. 9. plaka okumak ve veri analiz Plaka plaka okuyucu makine üzerinde saymak. Antikor değerler sayar / saniye (CPS) olarak görüntülenir. Antikor düzeyleri gibi göreli bir dizin plaka okuyucu makineden alınan iletmek. Aşağıdaki denklemi dizinden Hesapla:Dizin değeri = [CPS (örnek) – CPS (negatif kontrol)] / [CPS (pozitif kontrolü) – CPS (negatif kontrol)]. Pozitif ve negatif antikor sonuçları 99 100 sağlıklı kontrol konuların (diyabetik olmayan bireyler bilinen herhangi bir otoimmün hastalıklar ve şeker hastalığı aile öyküsü olan olmadan) göre kesme için tanımlanan pozitifliği, kullanarak tanımlayın.

Representative Results

Şekil 2 Dama Tahtası görüntüler. O 250 ng/mL biotin ve 250 ng/mL Sulfo-etiketinin etiketli antijen vardır tahlil’ın arka plan ve oranı yüksek pozitif denetimi örneğini, negatif kontrol örnek gelen sinyalleri dikkate alınarak tahlil kullanılan en rasyonel konsantrasyonları gösterilir olumlu olumsuz sinyaller. için Bu iki etiketli antijenleri en iyi duruma getirilmiş konsantrasyonları ile tahlil T1D ve 100 sağlıklı kontrol ile 100 yeni teşhis edilmiş hastalarda serum numuneleri ile gerçekleştirildi. 0.023 dizin değeri pozitif tahlil kesme olarak tanımlanmıştır. Bu sağlıklı kontrol karakteristik (ROC) eğrisi şekil 3Aiçinde gösterilen faaliyet alıcı kullanarak hastalar ve % 99 özgüllük % 85 duyarlılık gösterir. Tahlil için bilinmeyen örnekleri iç standart yüksek pozitif, düşük pozitif ve negatif kontrol örnekleri ile yapılmıştır. CPS sayar sonuçları gösterilmektedir tablo 2A. CPS yüksek ve düşük pozitif denetimlerin 17903 [(19940+15866)/2 kırmızıyla vurgulanır demek] ve 839 [(857+820)/2], ve negatif denetimlerini 168 [(170+165)/2 yeşil renkle vurgulanmıştır]. Bilinmeyen örnekleri için dizin tarafından hesaplanır “(CPSörnek-168)/(17903-168).” Tablo 2B tüm örnekleri için hesaplanan dizin değerleri gösterir. 0.023 kırmızı, ayrıca tablo 2Akırmızıyla yazılmış CPS değerlere karşılık gelen yazılı daha büyük olan dizin değerleri. Bu değerler 99inci yüzdelik sağlıklı kontrol nüfusunun büyük olumlu sonuçlar olarak tanımlanır. Ne zaman bir irrasyonel antijen konsantrasyon kullanılır, tahlil yüksek bir arka plan, Tablo 2 C. içinde gösterildiği gibi olacak Pozitif antikorlar düşük düzeyde A2, A5, D1 ve gri tablo 2Dolarak vurgulanmış H4 değerleri gibi cevapsız olacaktır. Resim 1 : Üzerinde tek bir ECL IAA tahlil bivalent plaka yakalama Illustration. Adacık antikor Sulfo etiket antijen streptavidin kaplı plaka üzerinde katı fazda yakalanan biotinylated yakalama antijen için Birleşik serum köprüler içinde. Sulfo-etiket konjuge antijen plaka yakalanan tespiti ECL gerçekleştirilir. Bu rakam Yu değiştirildi ve ark. 11. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 2 : ROC eğrisi tahlil pozitifliği cut-off belirlenmesi için. Özgüllük % 85 duyarlılık karşılık gelen 99inci yüzdelik seçildi ve 0.023 dizin değeri temsil edilir. Tahlil bu üst sınırı 100 sağlıklı denetimlerden çekildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3 : Normal insan serumu ECL IAA sinyallerini engelleme Illustration. A: sinyalleri ECL IAA deneyleri bir insülin Monoklonal antikor (MoAb) ile büyük ölçüde normal insan serumu eklenmesi tarafından bloke edildi. İnsan serum asit ile tedavi edildi zaman PBS MoAb karşılaştırırken, sinyal kısmen restore edildi. B: sinyalleri bir ECL IAA tahlil 4 hasta sera ile önemli ölçüde asit tedavisi ile gelişmiş. Bu rakam Yu değiştirildi ve ark. 11. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4 : Mutiplex ECL tahlil Illustration. Antikor-antijen kompleksleri özel bağlayıcı ile sıvı faz oluşur. Belirli antikor-antijen-bağlayıcı kompleksleri özel bağlayıcı noktalar aynı tümünde de sınırlanmıştır. Plaka okuyucu makine sinyalleri noktalar farklı kaynaklardan ayırt edebilir ve CPS sayıları 10 farklı kanallarda sırasıyla verir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Tablo 1: Denetleyicisi Yönetim Kurulu tahlil konsantrasyonları ve biotin oranları belirler ve Sulfo-etiket etiketli antijenleri. A: ham CPS plaka ve diğer yarısı negatif serum tarafındaki yüksek olumlu serum Denetleyicisi Yönetim Kurulu plakalı için sayar. Biotinylated antijen konsantrasyonu yatay dizi düşürülmüştü ve Sulfo-etiket antijen etiketli konsantrasyonu dikey dizi düşürülmüştü. B: CPS oranı değerleri sayar her biri kendi karşılık gelen CPS sayar negatif serum üzerinden karşı yüksek olumlu serum üzerinden. Sarı vurgulanan wells Panel b negatif pozitif en iyi oranı temsil eder. Bu oran 250 ng/mL için Biotin karşılık gelir ve 250 ng/mL Sulfo-etiket antijen konsantrasyonları negatif serum için çalışarak düşük bir CPS sayısı ile A panelindeki etiketli. Bu tablo daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Tablo 2: tahlil sonuçları analiz. Re: ham CPS tahlil plaka kırmızı ve yeşil ile standart negatif denetimleri vurgulanmış standart yüksek ve düşük pozitif denetimleriyle sayar. Her örnek tahlil çoğaltıldı. B: dizin değerlerini, tahlil protokolünde açıklandığı hesaplanmıştır. 0.023 büyük herhangi bir dizin değeri kırmızı renkte olumlu bir sonuç olarak tanımlanmıştır. C: bir irrasyonel antijen konsantrasyon kullanıldığında tahlil plaka örnekleri aynı kümesiyle ham CPS sayar. Bu yüksek bir arka planda sonuçlandı ve normalde tespit, bazı düşük pozitif negatif, gri Panel d vurgulanmış Panel b’de gösterildiği gibi çevrildi Bu tablo daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Adacık otoantikorlar şu anda otoimmünite tip 1 diyabet için en güvenilir biyolojik vardır. Adacık belirli otoimmünite başlangıcını işaretlemek ve aleni hastalık riskleri belirlemek. ECL tahlil adacık otoantikorlar için kapsamlı bir şekilde birden fazla ulusal ve uluslararası tip 1 diyabet klinik deneylere doğrulandı. Tahlil artan duyarlılık ve özgüllük geçerli ‘altın’ ile karşılaştırıldığında göstermiştir standart RBAs. ECL tahlil üstün avantajı yüksek hastalık özgüllük için ayrımcılık yüksek-benzeşme ve yüksek riskli adacık otoantikorlar RBA tarafından oluşturulan düşük riskli, düşük-ilgi sinyalleri tarafından göstermiştir. Bu sadece tek adacık antikor pozitif olan bireylerde özellikle fark ettim ve hiç tip 1 diyabet için hayli ilerlemiştir. Otoantikorlar sırasında kayıp bulundu bu düşük benzeşimini en içinde yıl, ay için bir ‘geçici olumlu.’ davranmaya test kadar izleyin Daha önce olan bu düşük benzeşme bağışıklama cross-reactive bir molekül ile gelen ‘tek’ otoantikorlar büyük olasılıkla sonuçlandı. Daha yüksek afinite daha yüksek risk adacık otoantikorlar bağışıklama adacık antijenleri kendilerini ile gelen sonuçlandı. Buna ek olarak, ECL deneyleri ‘serokonversiyonu’ zaman yıl klinik diyabet için doğumdan itibaren takip edildi öncesi Diyabetli Çocuklarda tarafından geçerli standart radyo-bağlama deneyleri (RBA) antedate yeteneğini gösterdi. Bir devam eden uluslararası klinik, çevre belirleyicileri diyabet içinde genç (oyuncak), zamanlama ve ilk adacık antikor ‘adacık çok başlangıcını kutlamak üzere serokonversiyonu’ görünümünü kesin olarak belirlemek için doğru algılama bağlıdır otoimmünite ve çevre Tetikleyicileri tanımlamak için. Tahlil tüm immünglobulin sınıfları yakalar ECL tahlil duyarlılık arttı olası bir nedeni var: IgG, IgM, IgA, IgE, tercihan–dan geleneksel RBA ya da sadece IgG algılamayı güvenen ELISA.

ECL deneyleri, IAA gibi belirli bazı otoantikorlar için otoantikorlar antijen için bağlama bazı bileşen normal insan serumu mevcut tarafından inhibe olabilir görünüyor. Kaldırmak veya bu inhibisyon serbest bırakmak için serum numuneleri asit tedavisi serum antijen ile inkübe önce yapmak gerekli. [Şekil 5], gösterildiği ECL IAA tahlil olarak fare insülin Monoklonal antikor ve hastaların serum otoantikorlar antijen ile bağlama faaliyetlerinin büyük ölçüde geliştirilmiştir. Serum numuneleri, antikor deneyleri içinde kullanılan asitleştirme genellikle önceden varolan ilişkili kompleksleri ilişkisini kaldırmak uygulanır. IAA sinyalleri nasıl insan serumu örneklerinde inhibe ve serum asitleştirme tarafından yayımlanan arkasında mekanizması bilinmiyor ama bu yöntem diğer dayalı ECL deneyleri14,15‘ te kullanılmıştır.

Birkaç durumda da, ne zaman moleküllerin etiketleme, Biotin ya da Sulfo-etiket, antijen protein moleküllerinin etiketleme positionsinside vardır, veya anahtar epitopları antikorlar için bağlama aktivite ile girişime neden olabilir antikor bağlama çok yakın. Bu tahlil hassasiyeti azaltır ve tamamen tahlil gözyaşı. Yordam etiketleme alışılmış çalışma yöntemi için maksimizasyonu veya doygunluğu her olası etiketleme konum etiketleme kapasitesi maksimize ederek maksimum etkinlik veya etiketli molekül başına sinyal oluşturmak her antijen protein molekül için arzu edilir. Doymamış etiketleme antijen üzerinde etiketleme kesinti antikor bağlama faaliyet olası bir neden olduğunda (Biotin ve Sulfo-etiket) antijen protein molekülleri etiketleme molar oranı azaltarak yapılmalıdır. Binbaşı epitopları daha iyi ayrılmış olabilir ve kesinti antikor bağlama faaliyet doymamış etiketleme stratejisi çoğu durumda kullanarak tahliye edilecek.

Her tahlil bir iç standart yüksek pozitif ve negatif kontrol bilinmeyen örneklerinin dizin hesaplamalar için içermelidir. Normal kontrollerin tahlil’ın üst sınırı yakınındaki bir düşük pozitif kontrol tahlil duyarlılığını izlemek için eklemek önemlidir. Laboratuvar yeterli aliquots uzun süreli kullanımı için standart pozitif ve negatif denetimlerini tutmalı ve tüm aliquots-20 ° C’de muhafaza edilmelidir Tahlil kalite güvencesi, deneyleri için her bir örneği diğerinin aynısı açmanız gerekir ve her olumlu sonuç örnek ayrı bir tahlil yinelenen tarafından onaylanması. İkinci doğrulama tahlil ilk tahlil ve katılıyorum iki deneyleri sonuçları ile kabul etmez zaman üçüncü bir tahlil gereklidir (örn., +, + veya-, -), pozitif veya negatif sonuç son belirlenmesi-ecek var olmak.

Tek ECL deneyleri için ayarla platformu ile çoğaltılmış bir tahlil üzerine bu genişletilebilir. Aynı anda bir tek iyi bir serum küçük bir miktar ile ilâ 10 farklı otoantikorlar belirleyebilirsiniz. Şu anda, IAA dahil olmak üzere dört adacık otoantikorlar GADA, IA-2A ve ZnT8A önem ilerlemesinde T1D için her iki akraba T1D ve genel nüfus hastalarda risk tahmini için eşittir. Zahmetli ve verimsiz, özellikle büyük ölçekli nüfus filtreleme için geçerli tek antikor ölçüler kullanarak bu 4 otoantikorlar eleme için kullanılan yöntemlerdir. Önemlisi, yukarı T1D hastalarının % 40’a bir ek otoimmün koşul16,17,18var. Ne yazık ki, bu koşullar için ekran için hiç kolay ve ucuz aracı vardır. Multiplex ECL tahlil sadece 4 geçerli büyük adacık antikor deneyleri birine birleştirerek yeteneğine sahip değildir, ama aynı zamanda daha fazla daha fazla antikor deneyleri ilgili diğer otoimmün hastalıklar birleştirmek yapabiliyor. Bu verimli bir şekilde yüksek işlem hacmi büyük ölçekli nüfus aynı anda birden fazla otoimmün hastalıklar için eleme kuralları sağlar. Multiplex ECL tahlil [şekil 6‘ da], gösterildiği gibi her antikor-antijen akışkan aşamasında oluşan karmaşık bir özel bağlayıcı kaynak noktaya aynı iyi ölçülü. Plaka okuyucu makine üzerinde sinyal alıcı noktalarından 10 farklı kaynaklardan gelen sinyalleri tanımak mümkün. Ancak, son derece yüksek bir sinyal lekeli bir yüksek tahlil arka plan oluşturmak ve çapraz-hadis ile komşu noktalar parazitlere neden. Bu nedenle, her antikor tayini için üst sınır sinyalleri için daha az 20.000 sayıları sınırlı olmalıdır. Deneyim, alt arka planlar ile otoantikorlar nispeten uzak nokta harita tasarlarken daha yüksek sayıları sahip bu noktalardan yerleştirilmelidir. Multiplex ECL deneyleri kullanarak uzun vadeli çalışmalar için aynı bağlayıcı tahlil tutarlı tutmak için aynı antikor tayini için kullanılması önerilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser NIH tarafından desteklenen DK32083, JDRF Grant 2-SRA-2015-51-Q-R verin.

Materials

Human recombinant proinsulin protein(PINS) AmideBio Human Proinsulin, Rec
Human recombinant GAD65 protein Diamyd rhGAD65
Human recombinant IA-2 protein Creative BioMart IA2
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
10x PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 70011-044
Bovine Serum Albumin (BSA) SIGMA-ALORICH A7906-500G
96-well PCR plate  Fisher 14230232
Streptavidin coated plate MSD L15SA
Zeba sizing spin column Thermo Fisher Scientific 89890
Twen-20 Fisher BP337-500
HCl Fisher A144-500
NaOH Fisher SS255-1
Trizma Base Fisher BP152-5
EZ-Link Biotin Thermo Fisher Scientific PI21329
Sulfo-tag MSD R91AO-1
Blocker A MSD R93AA-1
4x Read Buffer T with Surfactant MSD R92TC-1
EZ-Link NHS-PEG4-Biotin ThermoScience 21329
Sulfo-TAG MSD R91AO-1
96-well polymerase chain reaction (PCR) plate Fisher brand 14230232
96-Well Streptavidin plate MSD GOLD L 15SA-1
Zeba Spin Desalting Column ThermoScience PL208984
96-well Plate Shaker Perkin Elmer 1296-003
Plate Reader MSD QuickPlex SQ120
Benchtop centrifuge with bucket rotary Beckman Allegra X-15R
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Insel, A. I., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).
  2. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S. . Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment. Lancet. 358 (9277), 221-229 (2001).
  3. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. . Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
  4. Steck, A. K., et al. TEDDY Study Group. Predictors of progression from the appearance of islet autoantibodies to early childhood diabetes: The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY). Diabetes Care. 38 (5), 808-813 (2015).
  5. Krischer, J. P., et al. TEDDY Study Group. The 6 year incidence of diabetesassociated autoantibodies in genetically at-risk children: the TEDDY study. Diabetologia. 58 (5), 980-987 (2015).
  6. Achenbach, P., et al. Stratification of type 1 diabetes risk on the basis of islet autoantibody characteristics. Diabetes. 53 (2), 384-392 (2004).
  7. Achenbach, P., Bonifacio, E., Koczwara, K., Ziegler, A. G. . Natural history of type 1 diabetes. Diabetes. 54 (Suppl. 2), S25-S31 (2005).
  8. Steck, A. K., et al. Age of islet autoantibody appearance and mean levels of insulin, but not GAD or IA-2 autoantibodies, predict age of diagnosis of type 1 diabetes: diabetes autoimmunity study in the young. Diabetes Care. 34 (6), 1397-1399 (2011).
  9. Achenbach, P., Koczwara, K., Knopff, A., Naserke, H., Ziegler, A. G., Bonifacio, E. Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes. J Clin Invest. 114 (4), 589-597 (2004).
  10. Yu, L., Dong, F., Miao, D., Fouts, A. R., Wenzlau, J. M., Steck, A. K. . Proinsulin/insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).
  11. Yu, L., Miao, D., Scrimgeour, L., Johnson, K., Rewers, M., Eisenbarth, G. S. . Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).
  12. Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).
  13. Yu, L. . Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay. Methods Mol Biol. 1433, 85-91 (2016).
  14. Myler, H. A., McVay, S., Kratzsch, J. . Troubleshooting PEG-hGH detection supporting pharmacokinetic evaluation in growth hormone deficient patients. J Pharmacol Toxicol Methods. 61 (2), 92-97 (2010).
  15. Zhong, Z. D., Dinnogen, S., Hokom, M., et al. Identification and inhibition of drug target interference in immunogenicity assays. J Immunol Methods. 355 (1-2), 21-28 (2010).
  16. Barker, J. M., Yu, J., Yu, L., Wang, J., Miao, D., Bao, F., et al. Autoantibody "subspecificity" in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups. Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).
  17. Triolo, T. M., Armstrong, T. K., McFann, K., Yu, L., Rewers, M. J., Klingensmith, G. J., et al. Additional autoimmune disease found in 33% of patients at type 1 diabetes onset. Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).
  18. de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. . Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus. Neth J Med. 65 (7), 235-247 (2007).

Tags

ElectrochemiluminescenceIslet AutoantibodiesType 1 DiabetesAutoimmuneNon-radioactiveRadioassayELISAInsulin AutoantibodyBiotinSULFO-TAGSpin ColumnCheckerboard AssayPhosphate Buffered Saline

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gu, Y., Zhao, Z., Miao, D., High, H., Yang, T., Yu, L. Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies. J. Vis. Exp. (133), e57227, doi:10.3791/57227 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image