人胰岛自身抗体的电化学发光测定

1. 缓冲准备 标签缓冲 (2x pbs, pH 值 7.9): 在400毫升的蒸馏去离子 (DD) 水, 添加100毫升的 10x PBS, 调整 pH 值为7.9 与氢氧化钠。 3毫米生物素: 将1毫克的生物素溶于588µL 的标记缓冲液中。 3毫米的磺标签: 在50µL 标签缓冲器中溶解 150 nmol 的磺标记。 抗原缓冲 (5% BSA): 500 毫升 1x PBS, 添加25克牛血清白蛋白 (bsa)。 准备0.5 米醋酸溶液。 1.0 米的三盐酸缓冲液 pH 值 9.0: 准备1米三盐酸缓冲液, 并将 ph 值调整为9.0 与 hcl。 涂层缓冲器 (3% 阻挡剂 a): 在500毫升 1x PBS 中, 添加 15 g 的阻滞剂 a。 洗涤缓冲器 (0.05% 吐温 20, PBST): 在5000毫升 1x PBS, 增加2.5 毫升的补间20。 读取缓冲区 (2x 读取缓冲 t 与表面活性剂): 在 DD 水的500毫升, 添加500毫升4x 读取缓冲 t 与表面活性剂 (材料表)。 储存生物素和磺标签在一个-20 °c 冰箱。注意: 生物素和磺标签的解决方案应该总是在标签程序前刚准备好。 2. 用生物素和磺标记人胰岛 Autoantigen 注: 高浓度的抗原, ≥0.5 毫克/毫升, 建议更有效的标签反应。 测定人胰岛 autoantigen 对生物素和磺标记的摩尔比。 通过分子量除以抗原重, 获得抗原摩尔数。 使用1:5 的摩尔比的抗原与较小的分子量 (≤10 kd), 和摩尔比率为1:20 的抗原与较大的分子量 (> 50 kd)。 通过将摩尔数除以浓度, 计算生物素或磺标记的体积。 将人胰岛 autoantigen 与生物素或磺标记混合, 摩尔比为1:5。注: 三种或甘氨酸缓冲系统中的蛋白质应使用 “上浆自旋” 柱, 用 pH 值为7.9 交换到 2x PBS 缓冲器。 由于生物素和磺标记是轻的敏感, 用铝箔覆盖反应管。在室温下 (RT) 孵育1小时的反应。 在孵化过程中, 通过将 2x PBS 缓冲区分配到三次柱中, 将自旋柱放在最上方。每一次离心溶液在 1000 x g 2 分钟。注: 目前的标签反应, 通过衔接, 仍在发生, 需要停止。 通过纯化标记的人胰岛 autoantigen, 停止标记反应。要净化, 通过 autoantigen 通过旋转柱和离心机的列在 1000 x g 2 分钟。 用抗原蛋白的数量和最终体积确定标记抗原浓度 (µg/µL)。注: 大致上, 每一个自旋柱通过后, 将有 90-95% 的标记抗原保留。 整除标记抗原和存储标记抗原在-80 °c。 3. 定义检测的两个标记抗原的最佳浓度和比值 (检查板检测) 准备两个血清样本, 一个高阳性和一个阴性, 总容积为每µL 200。 整除4µL 的血清和添加 1x PBS, 直到最终体积是20µL 每井96井 PCR 板。对高阳性样本使用半盘, 另一半用于负样本, 如图 2A所示。 添加10µL 的生物素和10µL 的磺标记抗原, 并对两种不同标记的抗原进行串行稀释, 如图 2A所示。对一个标记抗原进行水平序列稀释, 并对其他标记抗原进行垂直序列稀释。 继续其余的化验步骤, 在5.3 至9.1 所述。 根据图 2B中显示的阴性样本中的每个对应信号, 计算高阳性样本的信号比。 通过选择最高或接近阳性率为阴性的点, 确定生物素和磺标记抗原的最佳浓度。考虑从阴性样品的低背景信号, 以确定比例。注: 化验日1包括步骤4至步骤6。 4. 用正确浓度的生物素/磺标记抗原制备抗原缓冲器 选择每个抗原的合理浓度的基础上检查板化验。 用生物素/磺标记抗原的合理浓度对抗原缓冲器进行3毫升抗原溶液的制备。 5. 用标记抗原孵化血清标本 注: 本节有两种协议, 一是无血清酸治疗, 一是血清酸治疗。除 iaa 检测外, 所有胰岛自身抗体的测定均采用常规的无血清酸治疗方法, 从步骤5.1 到 5.5, 而 iaa 检测跳过这些步骤, 并使用从步骤5.6 到5.9 的血清酸治疗的协议。 整除4µL 的血清和添加 1x PBS, 直到最终体积是20µL 每井96井 PCR 板。 每井加20µL 标记抗原溶液。 用密封箔覆盖 PCR 板以避免光线。 把盘子放在2小时的 RT 上 (低速)。 把盘子放在4摄氏度的冰箱里, 一夜之间孵化 (18-24 小时)。注: 以下步骤从5.6 到5.9 的协议仅为 IAA 检测和其他自身抗体化验而设计, 跳过这些步骤。 将15µL 的血清与18µL 0.5 米醋酸的血清样品混合在一起。在 RT 中孵化这种混合物45分钟。 采用抗原缓冲剂, 在检测板检测的基础上, 利用生物素和磺标记抗原的合理浓度, 制备抗原溶液。在每一个井中, 整除35µL 抗原缓冲, 含有生物素和磺标记抗原, 进入新的 PCR 板。 在45分钟孵化 (步骤 5.6) 步骤完成之前, 增加8.3 µL 1 M 三 pH 9.0 缓冲到每个井的边在抗原板材 (步 5.6)。限制三缓冲器与抗原的混合是很重要的。立即转移血清的25µL, 用酸治疗, 在步骤 5.6, 入每个井并且鼓动解答。用密封箔覆盖 PCR 板以避免光线。 把盘子放在2小时的 RT (低速) 上, 把盘子放在4摄氏度的冰箱里, 让盘子在一夜之间孵化 (18-24 小时)。 6. 准备链亲和素板 从4摄氏度冰箱中取出一个链亲和素板, 让盘子进入 RT。 一旦链亲和素板在 RT, 增加150µL 3% 阻滞剂 A 对每个井。 用密封箔覆盖 PCR 板。 一夜之间在4摄氏度冰箱里孵化盘子。注意:化验日2包括步骤7至步骤9。 7. 将血清/抗原潜伏转移到链亲和素板上 第二天, 从冰箱取出链亲和素板, 从盘子里扔掉缓冲器。把一些干纸巾放在桌子上, 把盘子倒在上面, 直到井内没有缓冲。 用150µL 的 PBST 填充空链亲和素板, 并将 PBST 从盘子中抹去, 共三洗涤。 将血清/抗原潜伏的30µL 转移至链亲和素板。 用箔盖住盘子以避免光线。在一个低的设置, 在 RT 1 小时摇动板。 8. 洗盘子, 添加读缓冲器 把潜伏从盘子里扔掉。添加150µL 的 PBST 每井, 并丢弃的 PBST 从板块总共三洗涤。 洗涤后, 增加150µL 每井的读数缓冲区。注意: 在溶液中防止气泡是很重要的, 因为这会影响板读机上的平板读取方式。 9. 阅读板和分析数据 数一下板读机上的盘子。抗体值每秒显示为计数 (CPS)。 将从板读机接收到的抗体水平作为相对指数传递。从以下等式计算索引:索引值 = [cps (示例)-cps (负控制)]/[cps (正控制)-cps (负控制)]。 确定阳性和阴性抗体结果使用的截止为阳性, 定义基于第九十九分百分100健康控制对象 (非糖尿病人没有任何已知的自身免疫性疾病和谁没有家庭病史的糖尿病)。