Pax7 和层粘连蛋白抗体免疫荧光法鉴定骨骼肌卫星细胞
Summary
卫星细胞的精确识别对于研究其在各种生理和病理条件下的功能至关重要。本文提出了一种基于免疫荧光染色的成人骨骼肌切片卫星细胞识别的协议。
Abstract
免疫荧光是一种有效的方法, 有助于识别不同的细胞类型的组织切片。为了研究所需的细胞数量, 在组织切片上应用特定细胞标记的抗体。在成年骨骼肌中, 卫星细胞 (SCs) 是促进肌肉修复和再生的干细胞。因此, 在不同的生理条件下, 对卫星细胞种群进行可视化和跟踪是十分重要的。在静止的骨骼肌中, SCs 位于基底叶片和肌纤维膜之间。在肌纤维或细胞培养中, 用于识别 SCs 的常用标记是配对盒蛋白 Pax7。本文提出了一种优化 Pax7 免疫荧光协议的骨骼肌切片, 最大限度地减少非特异染色和背景。另外还添加了一种识别基底叶片蛋白质 (层粘连蛋白) 的抗体, 以帮助识别 SCs. 类似的协议也可以用来执行双重或三重标记与 Pax7 和抗体的额外蛋白质的兴趣。
Introduction
骨骼肌由多核肌肉细胞组成, 称为 myotubes, 组织在肌纤维, 通过收缩产生力量和运动。大多数骨骼肌, 除了一些头面部肌肉, 都来源于一个叫做 somite1的临时胚胎结构。肌原细胞分层从上皮 somite 变成成细胞。成肌细胞进一步分化为 myotubes 形成多核肌纤维。上述过程称为肌, 其特点是由世俗调控的基因表达控制。肌质前体表达 Pax3 和 Pax7, 而成细胞表达 MyoD 和/或 Myf5 和肌细胞膜表达肌形成蛋白和球蛋白2, 3.肌肉生长是一个过程中, 肌纤维变得更大, 通过加入更多的 myonuclei 到现有的纤维 (增生) 和增加肌肉纤维大小 (肥厚) 4.在肌肉生长过程中, 有一个可持续的肌细胞来源, 它们具有干细胞的特性, 可以区分和自我更新。这些细胞被称为卫星细胞的基础上, 其物理位置之间的肌膜包裹 (细胞膜的肌纤维) 和基底叶片5。SCs 在青少年时期 (前2-3 周的产后小鼠) 大力促进肌肉生长, 但在休息的成年肌肉中成为静止的6。值得注意的是, 它们可以重新激活, 以应对肌肉损伤, 并分化为新的肌肉细胞, 以修复受损的肌肉7。
干细胞的性质使研究的 SCs 相关的基本肌肉生物学和治疗肌肉疾病的8。因此, 在过去几十年中, 它一直是一个激烈调查的领域。在剖析 SCs9、10的遗传学和表遗传学方面取得了巨大进展。在11的方式下开发并优化了用于隔离和识别 SCs就地的技术。免疫荧光染色可通过使用特定的抗体 (包括 Pax7) 识别 SCs。然而, 由于 SCs 的稀缺性和体积小, 结合了成人骨骼肌组织的强烈的自动荧光, 使可视化具有挑战性。在这里, 我们描述了一个免疫荧光染色协议优化的小鼠肌肉组织为 Pax7 和基于现有的方法, 斑马鱼肌肉12。此外, 用一个带有明显荧光的层粘连蛋白抗体来识别 SCs 所在的基底层。该议定书一贯允许在所有经过测试的生理条件和发育阶段 Pax7-positive SCs 和肌原体的可视化。
Protocol
Representative Results
Discussion
上述协议是基于对斑马鱼骨骼肌的 Pax7/MF20 染色方法12。使用的解决方案和阻止步骤是相同的或类似的。使用的抗体是相同的。调整后的步骤是基于小鼠肌肉组织和 SCs 的特点。首先, 在混合中加入层粘连蛋白抗体, 以帮助可视化和确认 SCs 的位置。在使用488/555 的双滤池时, 在显微镜下计算 SCs 的数量特别有用;这大大增强了 SC 衍生的 Pax7 信号, 脱颖而出, 从嘈杂的 autofluorescent 背景?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢结缔组织国立研究院光成像部分提供显微镜和技术帮助。MF20 和 Pax7 抗体是从发展研究中获得的, 在发育研究院的主持下开发的杂交瘤银行, 由爱荷华州的爱荷华大学生物科学系维护。这项工作得到了国家卫生研究院结缔组织国立研究院的校内研究项目的支持。
Materials
| methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | |
| 10x PBS | Gibco, Themo Fisher | 70011-044 | |
| 16% PFA | TED PELLA | 50-00-0 | |
| Triton-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 0 1-6201 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-007-003 | |
| 20x Citrate Buffer | Thermo Fisher | 00 500 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Laminin polyclonal rabbit antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-21121 | |
| Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21242 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher | A32732 | |
| Leica CM1860 cryostat | |||
| Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope | |||
| Leica DMR wide-field fluorescent microscope | |||
| Zeiss LSM510 confocal microscope | |||
| Zeiss LSM780 confocal microscope | |||
| Cuisinart electronic pressure cooker |
References
- Buckingham, M. Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).
- Buckingham, M., Relaix, F. PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis. Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).
- Relaix, F., Buckingham, M. From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network. Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).
- Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. Satellite Cells in Muscular Dystrophy – Lost in Polarity. Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).
- Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Satellite cells, the engines of muscle repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).
- Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks. Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).
- Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).
- Giordani, L., Puri, P. L. Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes. FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation. Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).
- Juan, A. H., et al. Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells. Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).
- Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts. Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).
- Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).
