Сбор и обработка лимфатических узлов от крупных животных для анализа РНК: подготовка исследований транскриптомики Лимфоузел крупных видов животных

РНК последовательности анализа транскриптом лимфатических узлов обеспечивает возможность характеризовать иммунная реакция животных на целый ряд патогенов. Хотя эта методология широко использовались в мышей, анализ недавно расширяется в больших млекопитающих^1,2. Скот и крупных животных лимфатические узлы могут использоваться для характеризуют разместить ответы на инфекции, не только для их использования в вакцины или генетической предрасположенности исследований, так и для определения целевых показателей для разработки лекарственных средств, но и как модель системы для человека исследования на зоонозных заболеваний. Например в случае бруцеллеза (зоонозных бактериальных заболеваний, что воздействие полмиллиона людей во всем мире каждый год), несмотря на значительно увеличить расходы, исследования в овец или коз более актуальны для инфицирования человека и человеческой вакцины развития, чем лабораторные животные модели. Модели мыши инфекции пилки ретикулоэндотелиальной системы инфекции, но не характерных клинических признаков³_.

В крупных животных эксперименты по сравнению с лабораторных исследований на животных процесс ткани, уборки обязательно включает в себя более длительную задержку между эвтаназии и ткани коллекции, которая представляет собой потенциальный вызов для сохранения высокое качество РНК. Нетронутыми РНК имеет важное значение для поколения биологически соответствующих транскриптомики данных. Поколения высокого качества РНК из образцов ткани особенно важно для крупных животных патогенов исследований проводится в изолирующего оснащения. Такие исследования являются по своей сути сложнее выполнять, поскольку они не только требуют утверждения зал и высоко квалифицированного персонала, но также осуществляем значительные финансовые расходы, которые, в зависимости от работы, может варьироваться от нескольких десятков до сотен тысяч долларов. Эти типы исследований также включать кросс дисциплинарного сотрудничества и кросс дисциплинарного знания для их завершения, добавляя к их сложности. Таким образом, обучение, развитие и приверженность рациональной системы для сбора и сохранения обеспечивает значительные преимущества течению молекулярных исследований тканей от зараженных животных.

В коллекции более крупных лимфатических узлов представлены дополнительные проблемы для коллекции тканей, по сравнению с аналогичными выборки мышиных лимфатических узлов. Подготовка образца иссечение требует базового понимания анатомии лимфатических узлов, включая соответствующих внутренних структур. Структуры лимфатического узла состоит из лимфоидных долек, окруженный пазухи заполнены с лимфы. Эти структуры заключаются в жесткой, фиброзной капсулы. ⁴ лимфоидных долька является «основной анатомической и функциональной единицей лимфатических узлов» и состоит из фолликулов, глубоко корковых подразделение и Медуллярного шнуры и пазухах⁴ (рис. 1A). Лимфоцитов T и B являются домом для фолликулов и глубоко корковых единиц, соответственно. Эти структуры обеспечивают 3D леску и облегчить взаимодействие между лимфоцитов и антиген или антиген представляющих клеток.

Грубо, фолликулы и глубоко корковые блоки могут быть определены на поверхности среза как они содержат более плотной сети ретикулярные и темнее чем придаточных пазух носа, которые состоят из более тонкие ретикулярных сеть и светлее (рис. 1B). Конвенцией патологов относятся к области лимфатических узлов как поверхностные коры (фолликулов), paracortex (глубоко корковых единиц) и продолговатого мозга (Медуллярного шнуры и придаточных пазух носа). Надлежащее рассмотрение всех трех регионов был признан как лучший практика в обычной патологических экспертизе лимфатические узлы⁵. Обратите внимание, что существуют значительные различия в последовательности, размер и цвет лимфатических узлов, даже в пределах одного животного. Как возраст животных их лимфатических узлов, как правило, будет уменьшаться в размерах и становятся тверже, чем у молодых животных, обычно за счет увеличения их соединительной ткани и сокращение нормальных лимфоидных структуры^6,7.

Рис. 1. Анатомия лимфатического узла. (A) это изображение мультфильм показывает анатомию лимфоузлов, изображающие ключевых структур. (B) это еще изображение показывает бычий лимфоузлов, сократить в поперечном сечении. Будут выделены соответствующие структуры/слои, которые видны невооруженным глазом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

В зависимости от экспериментальных вопрос различные лимфатические узлы будут представлять интерес для сбора и анализа. Периферические лимфатические узлы являются те расположен глубоко в подкожной клетчатке. Крупного рогатого скота, периферийных устройств или поверхностные лимфатические узлы часто используются в клинической и экспериментальной практике включают околоушной, подчелюстные, заглоточный, предлопаточные, предбедренные (precrural) и поверхностные паховые (supramammary у самок, мошонки у самцов) () Рисунок 2). В таблице 1изложены свойства ключевых поверхностных лимфатических узлов, как описано в⁸системы крупного рогатого скота. Ниже представлены некоторые потенциальные лимфатических узлов коллекции планы инфекционных бактериальных болезней крупного рогатого скота как отправной точки для проведения расследования.

Бруцеллы абортуса/бруцеллы melitensis: стандарт necropsies для B. абортуса-инфицированных скот и B. melitensis-инфицированных коз в национальном центре болезни животных восстановить supramammary, prescapular и околоушной лимфатический узел ткани , как для измельчения для бактериальных перечисления, а также для подготовки РНК для профилирования выражение принимающей РНК. B. абортуса может восстанавливаться регулярно в каждом из этих лимфатических узлов в экспериментально зараженных скота⁹_. Присутствие бактерий в каждом из этих типов лимфатических узлов может быть обнаружен в B. melitensis-инфицированных коз до по меньшей мере девять месяцев послеоперационные инфекции с использованием методологии на базе РНК из нашего исследования (Boggiatto et al., неопубликованные). Сальмонелла SP.: prescapular, лимфатического (предбедренные), и брыжеечных лимфатические узлы были полезны во время профилирования туш крупного рогатого скота для сальмонеллы распространенности^10,и^11,12 и бы потенциальный интерес для транскриптомики исследования. Кишечной палочки O157: H7: брыжеечных лимфатические узлы (в среднем тонкой кишки и дистальной части тонкой кишки местах) могут быть сайты время от времени восстановления бактерий в зараженных телят (но не в инфицированного взрослого скота)¹³. Лептоспироз (Лептоспире sp.): хронический сохранение бактерий наблюдается в лимфатических узлах, осушение молочной железы¹⁴. Mycobacterium bovis : Крупного рогатого скота бактерии были восстановленные после экспериментальной инфекции от средостения и Трахеобронхиальные лимфоузлы телят¹⁵. Кроме того лимфоузлов РНК была использована для изучения крупных животных принимающих ответы вирусов, таких как вирус свиного репродуктивного и респираторных синдром². Рисунок 2 изображает расположение подмножество этих крупных лимфатических узлов в организме скота.

Рисунок 2: Мультфильм с изображением выбранной Лимфоузел мест в Bos taurus . Аннотированная пронумерованных лимфатические узлы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

В этом документе и связанные видео мы представляем собой протокол для изоляции крупных лимфатических узлов животных РНК исследований, разработан, чтобы быть информативным для молекулярные биологи, участвующих в исследованиях транскриптомики крупных животных инфекций. Во-первых мы предоставляем обзор процедуры изоляции лимфатических узлов, используя выборки из тканей говядину и зубров в качестве примеров. В паре с этой демонстрации, как показано в видео, — это рабочий процесс для воспроизводимых ткани выборки для изоляции РНК. Далее мы описывают важные соображения для обработки зараженных лимфатических узлов, с уделением особого внимания безопасности, согласованности и качества РНК.

Подготовка РНК из ткани с Изотиоцианаты реактивом подкисленных фенол Гуанидин основывается на оригинальный метод Chomczynski и Сакки^16,17, с очисткой столбцов на основе силики спина в присутствии chaotropic агенты, основанный на оригинальной работой Фогельштейна и Гиллеспи¹⁸. Мы также изучить возможности для восстановления РНК для transcriptomics от скота лимфатических узлов, консервированные в альтернативных методов. Наконец, мы исследуем влияние переменной среды на качество РНК в крупных животных necropsies, включая представителя эксперимент с изображением эффект увеличения времени между эвтаназии и выборки на восстановленные профиль РНК из зубров и говядину лимфатические узлы. Эта статья будет полезна не только молекулярные биологи, но также для ветеринарных исследователей, начиная с исследования транскриптомики.