En Optogenetic metod för att kontrollera och analysera gen uttrycksmönster i Cell-till-cell interaktioner
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att analysera cell till cell överföring av oscillerande information av optogenetic kontroll och live övervakning av genuttryck. Detta tillvägagångssätt ger en unik plattform för att testa en funktionell betydelse av dynamiska gen uttryck program i flercelliga system.
Abstract
Cellerna bör svara ordentligt på temporally förändrade miljöer som påverkas av olika faktorer från omgivande celler. Skåran signaling pathway är en av sådan grundläggande molekylära maskineri för cell-till-cell kommunikation som spelar viktiga roller i den normala utvecklingen av embryon. Denna väg innebär en cell till cell överföring av oscillerande information med ultradian rytmer, men trots framsteg i molekylärbiologiska tekniker, det har utmanande för att belysa effekterna av flercelliga interaktioner på oscillerande gen Dynamics. Här presenterar vi ett protokoll som tillåter optogenetic kontroll och live övervakning av genen uttrycksmönster temporal preciserad. Denna metod avslöjade framgångsrikt att intracellulära och intercellulära periodiska ingångar av Notch signalering stiga på tåg inneboende svängningar av frekvensinställning och fas skiftande med encelliga upplösning. Detta synsätt är tillämpligt på analysen av de dynamiska funktionerna i olika signalvägar, som ger en unik plattform för att testa en funktionell betydelse av dynamiska gen uttryck program i flercelliga system.
Introduction
Cell-till-cell kommunikation spelar avgörande roller i embryonala mönstring i utvecklingsprocesser. I ryggradsdjur embryon bildas de Metamera strukturer som kallas thoraxsegmenten längs främre-bakre kroppen axeln med en exakt temporal noggrannhet under kontroll av en tidsangivning klocka, kallas segmentering klockan1. Under denna process, en grupp presomitic mesoderm (PSM) celler omvandlas regelbundet till thoraxsegmenten i ett synkront sätt. Denna process omfattar synkroniserade oscillerande genuttryck och PSM celler som svänger i fas bildar de samma thoraxsegmenten. Det oscillerande genuttrycket är cirka 2 till 3 h i möss och ca 30 min i zebrafiskar. När dissocierade, PSM celler förlorar den sömnapparater2,3, men när de är åter samlade, de kan själv ordna och återställa den befolkning synchrony4, tyder på att cell-cell-koppling är en nyckel för den synkroniserade svängningar.
Omfattande insatser avslöjade att signalmolekyler i Delta-Notch väg är tätt anslutna till synkroniserade svängningarna av segmentering klocka generna. Antingen farmakologiska hämmare eller genetiska mutationer av Notch signalering desynchronize befolkningen av oscillatorerna. Mutanter av Notch signalering komponenter, såsom DeltaC, DeltaD och Notch1a, Visa i zebrafiskar, asynkron svängningar5,6. Chick eller mus embryon krävs inte bara Notch liganden Delta-like1 (Dll1) men också den Notch Modulator Lunatic fringe (Lfng) för synkroniserade svängningar7,8,9. Men det har varit svårt att testa den funktionella kapaciteten hos molekylerna för dynamisk informationsöverföring från cell till cell, eftersom temporal resolutioner av konventionella störning av genen förordning dynamics inte var tillräckliga för att undersöka den processer för tidsskalor på 2 – 3 h (ultradian rytmer).
Vi har nyligen utvecklat en integrerad metod för att kontrollera och övervaka gen uttrycksmönster i däggdjursceller10. Denna teknik möjliggör induktion av gen uttryck pulser av periodiska ljus belysning på ultradian tid-skalor. Detta protokoll representerar metoderna att upprätta ljuskänslig cell-linjer och respektera dynamiska svar av reporter cellerna genom live-cell luminiscens övervakning i sammanhang av cell-till-cell kommunikation. Denna metod är tillämplig till analysen av många andra signalvägar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi visade en metod att styra gen uttryck dynamics med en periodicitet på 2 till 3 h. Denna tidsplan är mycket kortare än de i andra konventionella system, inklusive det Tet-On-systemet och den ursprungliga LightOn. Viktiga parametrar att nå ultradian tidsfristerna är halveringstider för foto-inducerad molecular produkter, mRNA och proteiner. Dessa kinetiska parametrar kan bero på celltyper och arter. För trimning kinetik, är ersätter Hes1 3′ UTR sekvenser med andra ett okomplicerat sätt, eftersom det inte änd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av JST, PRESTO (AI), Core forskning för blickar vetenskap och teknik (JPMJCR12W2 (R.K.)), bidrag för vetenskaplig forskning på innovativa områden (undervisningsministeriet, kultur, sport, vetenskap och teknik (MEXT), Japan 26119708 (AI) och 16 H 06480 (R.K.)), vetenskapliga forskning (A) (Japan Society för främjande av vetenskap (JSPS) 24240049 (R.K.)), och unga forskare (A) (JSPS 15 H 05326 (AI)), och ett bidrag för vetenskaplig forskning på innovativa områden ”fluorescens Live imaging ”av MEXT, Japan och plattform för dynamiska metoder till Living System från MEXT, Japan.
Materials
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
References
- Hubaud, A., Pourquie, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).
- Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Tsiairis, C., Aulehla, A. Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns. Cell. 164, 656-667 (2016).
- Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock. Nature. 408, 475-479 (2000).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics. Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).
- Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock. Nature. 421, 275-278 (2003).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nat. Commun. 3, 1141 (2012).
- Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes Dev. 30, 102-116 (2016).
- Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information. Genes Dev. 31, 524-535 (2017).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).
- Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, S7 (2007).
- Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnology. 10, 3 (2010).
- Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -. M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
- Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. The onset of collective behavior in social amoebae. Science. 328, 1021-1025 (2010).
- Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160, 381-392 (2015).
