Determinar se o DNA manchada com um cianina tintura pode ser digerido com enzimas de restrição
Summary
Moléculas de DNA para microscopia de fluorescência de coloração permite que um cientista para visualizá-las durante um experimento. O método apresentado aqui, as moléculas de DNA são previamente coradas com corantes fluorescentes e digeridas com metilação e enzimas de restrição não-metilação sensíveis.
Abstract
Visualização do DNA para microscopia de fluorescência utiliza uma variedade de corantes como cianina corantes. Estes corantes são utilizados devido a sua alta afinidade e sensibilidade para DNA. A fim de determinar se as moléculas de DNA são comprimento total após a conclusão do experimento, um método é necessário para determinar se as moléculas manchadas são comprimento total por digestão com enzimas de restrição de DNA. No entanto, DNA manchada pode inibir as enzimas, portanto, um método é necessária para determinar que as enzimas se poderia usar para fluorocromo manchado de DNA. Neste método, o DNA está manchada com uma tintura de cianina durante a noite para permitir que o corante e DNA para equilibrar. Próximo, manchada de DNA é digerido com uma enzima de restrição, carregado em um gel e electrophoresed. As bandas de síntese de DNA experimentais são comparadas com um digest em silico para determinar a atividade de enzima de restrição. Se há o mesmo número de bandas como esperado, a reação é completa. Bandas mais do que o esperado indicam digestão parcial e menos bandas indicam digestão incompleta. A vantagem desse método é sua simplicidade e usa equipamento que precisaria de uma cientista para uma enzima de restrição do ensaio e electroforese do gel. Uma limitação deste método é que as enzimas disponíveis para a maioria dos cientistas são enzimas comercialmente disponíveis; no entanto, poderia ser usadas qualquer enzimas de restrição.
Introduction
A série TOTO (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, 3-POPO e BOBO-3; A tabela 1) é utilizado em uma ampla variedade de experiências onde a visualização do DNA é necessário1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. a família de dímero de cianina é amplamente utilizada devido a sua alta afinidade por moléculas de DNA a18,19,20, sensibilidade e rendimento quântico. Cianina dímero corantes tem grande seletividade para ADN encalhado dobro e quando intercaladas têm um aumento de 100 a 1000 vezes de fluorescência21. Corantes de piridínio (YOYO-1, TOTO-1, 3-YOYO e TOTO-3) tem um emissão comprimento de onda menor do que seus quinolium tingir (BOBO-1, 1-POPO, BOBO-3 e POPO-3) homólogos (tabela 1)22. Além disso, o rendimento quântico de dímeros cianina intercalados no DNA é alto (0,2 – 0,6)22. No entanto, usando uma enzima para determinação do perfil de metilação de uma molécula de DNA2 ou esticar23 de uma molécula de DNA já manchada com uma tintura fluorescente requer um método para determinar que enzimas digerirá DNA manchada. Qualquer tipo de corante que se intercala no ADN ou qualquer enzima que dá um padrão discernível do substrato DNA pode ser usada para este método.
Meng et al primeiro determinada a taxa de digestão de DNA prestained através de eletroforese em gel usando uma variedade de diferentes corantes24. Miranda et al analisaram no mais profundo de olhar para a família de totó de corantes. Ambos determinados a taxa de digestão de DNA manchada para ver se DNA manchada com uma tintura determinada pode ser digerido com uma enzima de restrição,25. Outros métodos de estudam efeitos vinculativos de corantes intercalados com DNA usando Pinça óptica26 ou NMR27. Qualquer método requer equipamento especializado; Considerando que, esse método permite que o equipamento que a maioria dos laboratórios de biologia molecular têm para determinar se uma tintura interfere com uma enzima de restrição de digestão.
Além disso, em outros métodos para medir o comprimento de uma determinada molécula, mapeamento óptico tem alongado imaculadas moléculas de DNA em uma superfície e digerido DNA para determinar a extensão e tamanho dos fragmentos. Intercalação de corante foi mostrada para aumentar o comprimento de contorno das moléculas de DNA fluorescente manchadas e dependendo do corante usado, os contorno dos comprimentos diferentes21. Este método tem sido utilizado em uma variedade de genomas1,3,4,6,13,28,29,30, 31. no entanto, se moléculas foram pre-manchadas, dependendo da tintura e a enzima, a enzima não pode ser capaz de cortar o DNA manchada com um determinado corante. Portanto, este método determina se o DNA manchada com uma tintura determinada pode ser digerido com uma enzima. Além disso, dependendo da concentração de corante e o corante utilizado, a mobilidade do DNA bandas em um gel irão migrar mais lentamente do que o DNA nativo devido a desenrolar parcial do backbone DNA para fazer o quarto para a tintura inserir entre pares de bases32 .
No entanto, às vezes estes corantes podem parcialmente ou completamente, inibir a ação de determinadas enzimas de restrição7,24. Isto é pensado para ser devido a uma mudança estrutural no causada pelo acessório do corante fluorescente, que pode impedir que a enzima reconhecendo sua sequência específica de DNA. Compreender como estes corantes afetam as enzimas de restrição pode ajudar em experiências onde o perfil de metilação ou trecho de DNA manchada é necessário.
Em nosso método, o DNA foi manchada com um fluorocromo de interesse e digerido com uma enzima de restrição. Então o DNA foi electrophoresed em um gel, cuja imagem, e a taxa de digestão de enzima de restrição foi medida. As enzimas de restrição foram escolhidas com base no padrão de corte em um gel. Muitas bandas causaram a sobreposição das bandas de DNA e muito poucas bandas não deu uma imagem completa da molécula de DNA. Há um ponto doce para ser capaz de determinar o perfil da molécula de DNA digerido; Portanto, dependerá do DNA usado e a enzima. Uma vantagem deste método é sua simplicidade; exige somente equipamentos utilizados em uma eletroforese de gel e digestão de restrição.
Protocol
Representative Results
Discussion
A fim de digerir fluorescente etiquetadas DNA (Figura 1), uma série de passos são necessários. Primeiro, DNA está manchada com um fluorocromo durante a noite. DNA pode ser incubada com dímeros cianina, por um período mais curto de tempo; no entanto, Carlsson et al encontraram que o DNA criado bandas duplas para cada tamanho de DNA devido à coloração incompleta20. Para remediar esta situação, o DNA pode ser manchado durante a noite …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto Nacional para geral médica ciência (NIGMS) (5605100122001), um componente do National Institutes of Health (NIH), bem como a Universidade de Nebraska em Kearney (UNK) programa de pesquisa de estudante verão (SSRP) e UNK Bolsa de iniciação científica (Al-URF).
Materials
| Unmethylated lambda DNA | NEB | N3013S | |
| YOYO-1 | ThermoFisher Scientific | Y3601 | |
| TOTO-1 | ThermoFisher Scientific | T3600 | |
| POPO-1 | ThermoFisher Scientific | P3580 | |
| BOBO-1 | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| YOYO-3 | ThermoFisher Scientific | Y3606 | |
| TOTO-3 | ThermoFisher Scientific | T3604 | |
| POPO-3 | ThermoFisher Scientific | P3584 | |
| BamHI | NEB | R0136S | |
| PmlI | NEB | R0532S | |
| ScaI | NEB | R3122S | |
| EcoRI | NEB | R0101S | |
| HindIII | NEB | R0104S | |
| SmaI | NEB | R0141S | |
| Tris | Fisher | BP152-1 | Irritant |
| EDTA | Fisher | S316-212 | Toxic |
| HCl | Fisher | S25358 | Corrosive and irritant |
| Buffer 1 | NEB | B7201S | NEB 1.1 |
| Buffer 2 | NEB | B7202S | NEB 2.1 |
| Buffer 3 | NEB | B7204S | NEB Cutsmart |
| High gelling temperature agarose gel | Lonza | 50041 | |
| Acetic Acid | Fisher | S25118 | Hazardous |
| Blue light transilluminator | Dark Reader | DR196 | Wear correct eyewear |
| Ethidium bromide | Fisher | 15585011 | Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc. |
| Cannon EOS Rebel T3I camera | Cannon | ||
| Apogee Model H4 | Biorad | 1704510 | |
| Power Pac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | BP525-25 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B-392 | |
| Xylene Cyanol | Eastmen | T1579 |
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