Microfluidic Chips voor In Situ Crystal röntgendiffractie en In Situ Dynamische lichtverstrooiing voor seriële kristallografie

Epoxy is een uitstekende vulling materiaal voor X-ray chip fabricage. Het is goedkoop, eenvoudig en robuust aan proces zonder specialistische gereedschappen (Figuur 1). Vermindering van de epoxy viscositeit door verder verdunnen het met 40 wt % ethanol vergemakkelijkt het verwijderen van overtollige hars boven de kristallisatie Nou, wat resulteert in gedefinieerde X-ray windows. Hogere ethanol verdunningen resulteerde in gebreken van de uitgeharde hars. Door het analyseren van Röntgen chip dwarsdoorsneden, vastbesloten wij de totale venster dikte van beide zijden om ongeveer 19 µm dik, die zeer dicht bij de nominale dikte van de gebruikte polyimide folies van 2 × 7,5 µm (Figuur 2) Kristallisatie proeven werden geïsoleerd in verschillende nanoliter formaat reactie compartimenten elk, met behulp van een capillaire ventiel mechanisme zoals eerder beschreven41. Deze ‘winkel-dan-maak’ laden techniek vermijdt het verlies van de steekproef van dode-volume kanaal en kan gemakkelijk worden uitgevoerd handmatig, eliminerend de behoefte pompen of andere apparatuur te gebruiken voor vloeiende bediening42. De chip is gevuld met gefluoreerde olie alvorens het waterige monster te laden. De oppervlaktespanning op de olie-water-interface tussen priming olie en waterige monster resultaten in een drukverschil op de interface. Deze druk Laplace is afhankelijk van zowel de straal van de kromming en de oppervlaktespanning van de interface. Om te minimaliseren zijn energie, moet de interface zijn oppervlak, die gelijk is aan het maximaliseren van haar belangrijkste kromtestralen bij constant volume minimaliseren. Een geringe kromming interface in een breed kanaal heeft een lagere druk van Laplace dan een hoge kromming interface in een smal kanaal segment. Dus, de stekker van de steekproef netcongestieproblemen binnenkomt en stroomt door de brede rondweg kanaal in plaats van door de beperkingen van de smalle capillaire ventiel stroomt. Tot slot wordt de stekker van de steekproef gevolgd door gefluoreerde olie om te scheiden van de monster-putten in onafhankelijke druppels. Robuuste en betrouwbare laden werd bereikt met een spuitsnelheid van maximaal 1 mL/h, in zowel een serienummer en een parallelle goed regeling (Figuur 3). In de ‘seriële’ lay-out, zijn goed inlaat en capillaire ventiel beperkingen sequentieel aangesloten via een bypass kanaal31 In tegenstelling, in de “parallelle” lay-out, twee aparte belangrijkste kanalen verbinden alle goed inhammen of capillaire kleppen alleen43. Beide concepten regeling worden eerder gecombineerd met formulering controle scherm samenstelling, dat een nuttige aspect in eiwit kristallisatie43,44. Het seriële ontwerp heeft slechts twee vloeibare poorten, een inlaat en een uitlaat. Het heeft minder vloeibare havens, en vanwege dit, is het eenvoudiger om te bouwen en te beheren. De parallelle lay-out heeft 4 vloeistof poorten, 2 voor het belangrijkste kanaal aansluiten van de putten en 2 voor het koppelen van de capillaire kleppen om lucht of ontsnappen van de overtollige olie te laten. Laden kunt vandaar verder aan weerszijden van de belangrijkste kanaal. Deze lay-out is over het algemeen lagere stromingsweerstand voor een gelijk aantal putten te wijten aan de kortere omleiding. Het is daarom beter geschikt voor up-scaled apparaten met een hoog aantal wells. Ook de monster-putten zijn georiënteerd samen dichter, die voordelen biedt voor geautomatiseerde imaging. Volledige monster goed laden werd waargenomen voor beide lay-outs, als ofwel gebouwd als een twee-hoogte of een drie-hoogte ontwerp. In een ontwerp met twee-hoogte zijn zowel het monster goed en de rondweg kanalen van gelijke hoogte. Het ontwerp van de drie-hoogte vereist een derde masker, een extra SU8 laag en een stap in de uitlijning verder te verzekeren dat de steekproef putten hoger is dan de voorgaande worden kanalen omzeilen. Deze hoogte-differential bevordert invoeren van monster vloeistof in de put via het dezelfde capillair kleppen beginsel dat stroom op de beperkingen stopt. Hier, het hogere goed plafond komt overeen met een lagere Laplace druk van de oprukkende meniscus en stroom langs de rondweg richting alleen favoriet is nadat wells volledig hebt ingevuld, zodanig dat de beperkingen van de klep verder stroom blokkeren en het doorschakelen naar beneden de bypass. Echter is succesvol laden niet strikt vereist de putjes hoger dan de bypass zoals passende capillaire kleppen kan ook worden bereikt door kanaal breedtes dienovereenkomstig aan te passen. Echter in onze ervaring, de hogere putten aanzienlijk meer robuust uitgevoerd en defect gratis laden werd waargenomen op maximaal tien keer hoger debiet in alle ontwerpen van drie-hoogte ten opzichte van hun twee hoogte-equivalenten. Dit effect was meer uitgesproken in de parallelle lay-out. Om na te bootsen damp diffusie kristallisatie kinetiek, was de eindige permeabiliteit van de folie van polyimide benut om het water verdamping na verloop van tijd te controleren. Experimentele verdampingssnelheden werden gekwantificeerd door de wijziging van druppel volume na verloop van tijd door het gelijkstellen van de daling van de oppervlakte en goed hoogte (figuur 4C). De verdamping van kristallisatie putten in de X-ray-chip gaat het niet verder op een lineaire wijze, als een krimpende oppervlakte van de druppel samenvalt met opgeloste concentratie resulteert in een verminderde verdampingssnelheid gedurende tijd45te vergroten. De eerste verdamping volgde een ongeveer lineaire groei van over 0.5 nL h-1 in putjes van de seriële layoutgeometrie. Om beter te begrijpen de kristallisatie kinetiek, werden DLS-metingen uitgevoerd in de putten van de kristallisatie van de microfluidic-chip. Voor eerste DLS metingen, was een chip van de PDMS gebonden op een glasplaatje gewend beter optische eigenschappen voorzien in de verstrooiing van licht-experiment. Deze chip had goed dezelfde afmetingen als de X-ray-chip. PDMS heeft een hogere waterdamp doorlaatbaarheid dan de polyimide van polyimide Vensters in de X-ray chip45. Aangezien flux lineair met afstand schalen, kan het traject van de verdamping van een windowed polyimide goed gepaard gaan met een overeenkomstige PDMS venster van de juiste dikte. DLS resultaten tonen aan dat de verdeling van de straal na verloop van tijd (figuur 4A-B) verandert, waaruit blijkt dat de metingen DLS toestaan om te ontdekken de eerste nucleatie alvorens eerste kristallijne deeltjes worden waargenomen. Deze informatie kan worden gebruikt voor nucleëren en groeien enkele kristallen per putje door extern aan te passen de verdampingssnelheid en vandaar oververzadiging niveaus in een vroeg stadium van de nucleatie46. De X-ray-chip werd vastgesteld op een 3D gedrukte adapter voor de SBS compatibel plaat goniometer op het EMBL-beamline van de synchrotron P14 bij PETRA III (figuur 5A). Als alternatief, een kleinere 3D afgedrukte frame kan worden gebruikt om mount X-ray chips om standaard beamline goniometers21. Thaumatine kristallen hebben een grootte van 10-20 µm (figuur 5B) en diffract tot een resolutie van 2.0 Å (figuur 5C). Zoals verwacht, de bijdrage van de X-ray achtergrond van de twee dunne polyimide folies windows vanaf de X-ray-chip is beperkt tot polyimide polymeer verstrooiing ringen op 11 Å (2θ ~ 5°) en 33 Å (2θ ~ 1,7 °) voor de X-ray golflengte van 0.97 Å. Deze twee ringen storen gegevensverwerking niet. Een totale dataset met 83 Thaumatine kristallen werd verzameld en 10 diffractie patronen werden geregistreerd vanuit elke kristal met een 1° rotatie tijdens elk frame. Gegevensverwerking en verfijning parameters, evenals de statistieken van de dataset Thaumatine zijn weergegeven en vergeleken met twee andere datasets van glucose isomerase en thioredoxin, die ook werden verzameld in situ zijn vermeld in tabel 3 en Tabel 4. Het verval van de intensiteit van de macht van de genormaliseerde diffractie na verloop van tijd werd onderzocht door het opsplitsen van de dataset Thaumatine in vijf sub datasets (twee diffractie patronen werden gebruikt per subset om volledige datasets). Zoals blijkt uit figuur 6B, de diffractie macht begon te dalen na de eerste sub-dataset en was onder de 50% in het vierde sub dataset. Dientengevolge, de waarden van de Rmeas van de sub-datasets zijn ook steeds meer na verloop van tijd, met vermelding van X-ray stralingsschade tijdens het verzamelen van gegevens. We veronderstellen dat vrije radicalen gegenereerd tijdens de X-ray blootstelling snel naburige kristallen in hetzelfde compartiment reactie degraderen. Bijvoorbeeld, dergelijke secundaire X-ray schade was dat minder uitgesproken in een verwante experimentele aanpak, waarbij over een aanzienlijk groter gebied in een polyimide sandwich21kristallen zijn rondgedeeld. U wilt algemene X-ray schade minimaliseren, moet slechts een klein aantal diffractie patronen uit een bepaald kristal worden verzameld bij kamertemperatuur. Ook, mag slechts één enkele eiwit kristal plaatsen per compartiment van de microfluidic-chip worden blootgesteld. Alle structuurmodellen verfijnd met behulp van de verwerkte datasets tonen echter zeer goede stereochemie en geschikt statistieken (tabel 4). Daarnaast waren alle laatste elektron dichtheid kaarten van zeer goede kwaliteit. In eerdere kristallografie benaderingen op X-ray transparante chips, de afdrukstand en de rangschikking van de kristallen moest opzettelijk worden gemanipuleerd om het verkrijgen van een willekeurige distributie van crystal oriëntaties40 of is verkregen door crystal bewegingen laag21binnen de vloeistof. Om te beoordelen in de X-ray transparante microfluidic chips beschreven in dit protocol de stand van de kristal, werd de oriëntatie van de mobiele eenheid van alle blootgestelde kristallen met betrekking tot het coördinatensysteem van het laboratorium vastgesteld. Voor de bipyramidal Thaumatine kristallen, werd een lichte voorkeur waargenomen (figuur 7A), terwijl we een brede distributie voor glucose isomerase kristallen (figuur 7B) verkregen. We redeneerde dat op de nanometerschaal, de meeste materialen aanzienlijke ruwheid vertonen. Vandaar, kristallen kunnen spontaan ervoor op het oppervlak in aanzienlijk minder vooringenomen oriëntaties spontaan. Deze kern van een klein kristal kan worden opgesloten in een oriëntatie, terwijl het voortdurend te groeien naar de juiste grootte zonder heroriënteren ten opzichte van de normale van het oppervlak. In feite, is oppervlakte gemedieerde crystal nucleatie al lang een last aan kristallografen proberen lus een bijgevoegde kristal vandoor naar de oppervlakte zonder beschadiging van het kristal in het proces. Hier, kunnen we direct gebruik maken van dergelijke kristallen voor diffractie gegevensverzameling. Systeem specifieke beperkingen bestaan echter, zoals de thioredoxin bleek een sterke voorkeur voor bepaalde oriëntaties in de xy-, xz- en yz-vlakken (Figuur 7 c). Toonde voorbeelden ziet u dat de verdeling van de geaardheid is niet alleen afhankelijk van op het milieu van de groei, maar ook op de vorm van kristal. De thioredoxin kristallen hebben langgerekte vormen die de neiging om te groeien in de gewenste richting, terwijl de tetragonale bipyramidal Thaumatine kristallen of de orthorhombisch glucose isomerase kristallen worden niet getoond voor dit probleem. Echter, in alle gevallen, zelfs met voorkeur oriëntaties die het toegankelijk bereik van crystal rotaties in voldoende goede dekking van reciproque ruimte en vandaar volledige gegevenssets voor alle resulteerde onderzocht eiwitten. Dus geen aanvullende maatregelen moesten worden genomen bij het selecteren van kristallen voor Xray blootstelling. Figuur 1 : Regeling van microfluidic X-ray chip fabricage. (1) SU-8 wordt aangeboden op een silicium substraat en spin coating om te verkrijgen van de gewenste laagdikte. (2) fotoresist is blootgesteld aan UV-straling door middel van een masker. (3) onbelicht fotoresist vervolgens weg is ontwikkeld door het achtereenvolgens wassen met PGMEA en isopropanol, resulterend in (4) een meester van de SU-8 voor het gieten van verdere stappen. (5) PDMS wordt gegoten op, en van de meester van de SU-8 (6) na het genezen van het PDMS schimmel, wordt gepeld. (7 bis) Epoxy lijm wordt aangeboden op de PDMS mal en (7b) een geactiveerde polyimide folie is chemisch gebonden aan de epoxyhars. (8) na uitharding wordt de polyimide folie met de patroon dunne epoxy-film uit de mal PDMS gepeld. (9) in een laatste stap moet het apparaat is hardplastic met een tweede polyimide folie aan het rendement van een gesloten lage X-ray achtergrond microfluidic chip. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2 : Foto (links) en microscopie beelden van cross-secties van de definitieve chips. Een representatieve kanaal segment (midden) en een kristallisatie waterput (rechts) uit twee afzonderlijke chips worden weergegeven. Pijlen geven aan gemeten afstanden. Alle afmetingen zijn in µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3 : Schema van kristallisatie goed ontwerpt met [A] parallelle of seriële indeling van [B], gezien vanaf de bovenkant en vanaf de kant met afmetingen aangegeven in µm. Typische kanaal hoogten waren: 50 µm omzeilen, 50-60 µm kristallisatie goed, 5-10 µm capillaire kleppen, overeenstemt met het goed van de volumes van ongeveer 2.5 nL (parallelle lay-out) en 8 nL (seriële lay-out). Vertegenwoordiger goed laden gedrag wordt weergegeven met behulp van kleurstoffen voor levensmiddelen. De chip was gevuld met 12 wt % 1H, 1 H, 2H, 2H-perfluoro-1-octanol in FC-43, voordat voedsel kleurstof werd geïnjecteerd in de opslag putten. Witte pijlen geven de richting van de stroom. Overzicht beelden van geladen apparaten Toon alle putjes geladen defect gratis, ter illustratie robuuste monster laden. De parallelle lay-out wordt geïllustreerd als een drie-hoogte design met kristallisatie wells hoger dan de bypass, terwijl de seriële indeling wordt afgebeeld als een twee-hoogte ontwerp met putten en met gelijke hoogte te mijden. Typische debiet waren ongeveer 150 µL/h tijdens het laden, maar defect gratis laden werd waargenomen voor debieten van maximaal 1 mL/h in een 3-hoogte-ontwerp. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4 : In situ dynamische licht verstrooiing van een kristallisatie ruim tijd. [A] microscopische opname serie van de kristallisatie goed. De opgeslagen druppel continu krimpt als waterdamp na verloop van tijd verdampt. Eerste Thaumatine microcrystals kan worden waargenomen na 4 h. [B] overeenkomstige hydrodynamische straal verdeling van de deeltjes van de Thaumatine gemeten door DLS tijdens hetzelfde kristallisatie proces gefotografeerd in [A]. De vorming van een tweede RADIUS-breuk, die aangeeft eerste nucleatie gebeurtenissen kunnen worden gezien na ongeveer 1-2 h. [C] vertegenwoordiger volume afnemen van twee referentie druppel volumes als gevolg van waterverlies door verdamping in de tijd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 5 : in situ diffractie gegevensverzameling. [A] individuele microfluidic chips zijn gemonteerd door een 3D gedrukte adapter die op een plaat goniometer (blauw). [B] Thaumatine kristallen in de microfluidic chip tijdens de X-ray blootstelling zoals beeld door de in-line Microscoop op beamline P14. [C] de diffractie van Thaumatine kristallen werd opgenomen naar een resolutie van 2.0 Å, met een verwaarloosbaar laag achtergrond. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 6 : Evaluatie van de gegevens van gegevens van de diffractie van Thaumatine kristallen in de microfluidic-chip, geregistreerd bij de kamer-temperatuur. [A] elektronen dichtheid van het model van de verfijnde Thaumatine met het frame 1-2 dataset alleen (blauwe contouren op 1,5 σ). [B] intensiteit verval van Thaumatine kristallen als een functie van X-ray dosis. [C] evolutie van de waarde van de Rmeas over X-ray dosis. Het vak percelen in [B] en [C] met kwartielen (bovenste waarden 75%, 50% van de gemiddelde waarden, lagere waarden 25% en gemiddelde) en snorharen met 95% betrouwbaarheidsintervallen vertegenwoordigen het bederf van de intensiteit van de diffractie en Rmeas van alle blootgestelde kristallen (n = 83). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 7 : Verdeling van eenheid cell oriëntaties in de microfluidic chip folie met betrekking tot het laboratorium coördinatensysteem. [A] de bipyramidal Thaumatine kristallen toonde een brede verspreiding van de oriëntaties die betrekking hebben op bijna 180° in de xy-(blauw), xz-vlak (groen) en yz-(red) vliegtuig. [B] glucose isomerase toont ook een brede distributie, terwijl [C] thioredoxin een sterke voorkeur voor bepaalde oriëntaties toonde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. SU8-laag Spin jas Pre bak Bloot Na bakken [65 / 95 ° C] [65 / 95 ° C] 1st laag: Wells 1000 RPM 0 / 10 min 200 mJ/cm2 1 / 4 min 15 µm SU8-3010 2nd laag: Bypass 2000 TOEREN PER MINUUT 0 / 16 min 220 mJ / cm2 1 / 5 min 35 µm SU8-3025 3rd laag: kleppen 3000 RPM 0 / 3 min 150 mJ / cm2 1 / 2 min 5 µm SU8-3005 Tabel 1: voorbeeld van het proces van de SU8 voor drie lagen parallelle X-ray chip ontwerp. Het bestellen van deze laag zal zorgen voor een PDMS mal gieten voor X-ray chip fabricage. Als u wilt schimmel direct een PDMS tijdens prototyping, omkeren de laag bestellen tijdens de master fabricage te starten vanaf de 3rd tot finish met de 1st laag in plaats daarvan. Eiwit Eiwitconcentratie Eiwit buffer precipitant Ruimtegroep, VOB vermelding Uitsterven coëfficiënt [M-1 cm-1] Thaumatine (Thaumatococcus daniellii) 40 mg mL-1 50 mM Bis-Tris, pH 6,5 1.1 M natriumkaliumtartraat, 50 mM Tris, pH 6.8 I4222, 1LR2 29420 Glucose isomerase (Streptomyces rubiginosus) 25 mg mL-1 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, pH 7,0 100 mM Bis-Tris, 2.7 M ammoniumsulfaat, pH 5.7 I222, 4ZB2 46410 Thioredoxin (Wuchereria bancrofti) 34 mg mL-1 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, pH 8,0 27,5% PEG1500, 100 mM SPG buffer, pH 6,3 P41212, 4FYU 24075 Tabel 2: Kristallisatie voorwaarden en ruimte groepen van eiwit kristallen voorbereid, inclusief de uitsterven coëfficiënt en VOB-code. Eiwit Aantal blootgestelde kristallen Aantal diffractie patroon per kristal Trilling bereik per blootstelling [°] Belichtingstijd [ms] VOB vermelding voor MR Thaumatine (Thaumatococcus daniellii) 103 10 1 40 1LR2 Glucose isomerase (Streptomyces rubiginosus) 69 100 0.1 80 4ZB2 Thioredoxin (Wuchereria bancrofti) 68 10 1 40 4FYU Tabel 3: röntgendiffractie gegevens collectie parameter. Data collectie statistiekeneen Thaumatine(Frame 1-20) glucose isomerase (Frame 1-100) thioredoxin(Frame 1-10) Beamline P14 Golflengte [Å] 0.96863 Ruimtegroep P41212 I222 P42212 Cel eenheidparameters: een = b, c [Å] 58.62, 151.48 93.91, 99.60, 103.04 58.45, 151.59 Aantal kristallen 101 41 34 Totale trilling [°] 10 10 10 Resolutie [Å] 30.1.1989(1.95-1,89) 30.1.1975(1.80-1,75) 30.3.2000(3.20-3.00) Temperatuur [K] 296 296 296 R p.i.m.b 7.5 (25,5) 8,8 (28,0) 9.1 (33.2) Gemeten reflecties 1553200 690000 1111196 Unieke reflecties 21850 48942 44449 Gemiddelde I/σ(I) 6,07 (1.78) 5.85 (1.66) 4.08 (1.47) Mn(I) half-set correlatie CC(1/2) 96,2 (72,2) 95,8 (68,2) 97.9 (75,3) Volledigheid [%] 99,8 (100.0) 100.0 (99,9) 99,9 (100.0) Redundantie 71,1 14.1 25 Verfijning statistieken Resolutie bereik [Å] 1/30/1989 1/30/1975 30-3-2000 R / Rgratis [%] 18.8/23.9 18.1/20.5 18.9/23.1 Eiwit atomen 1550 3045 1129 Watermoleculen 51 111 164 Ligand moleculen 20 0 0 RMS-afwijking Bond-lengte [Å] 0.02 0.026 0,01 Bond hoek [°] 2.04 2.22 1.43 B factor [Å2] Eiwit 22,6 20 50 Water 25.1 27.1 29,7 Ligand 20.4 Ramachandran plot analyse Meest geliefde regio’s [%] 97.67 95.32 96,13 Toegestane regio’s [%] 2.44 4.16 3,64 Royaal toegestaan regio’s [%] 0,49 0.52 0.23 a: waarden tussen haakjes zijn voor de hoogste resolutie shell. b: (), waar ik (hkl) is de gemiddelde intensiteit van de reflecties hkl, Σhkl de som over alle reflecties is en Σi de som meer dan ik is metingen van reflectie hkl. Tabel 4: Gegevens verzameling statistieken van datasets van Thaumatine, glucose isomerase en thioredoxin. Normalelichtdoorlatingsfactor-bestand 1: chip_geometry.dwg. CAD-bestand van de chip geometrieën gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden. Normalelichtdoorlatingsfactor-File 2: goniometer_adapter.stl. STL-bestand opgeven de X-ray chip goniometer adapter. Klik hier om dit bestand te downloaden. Normalelichtdoorlatingsfactor-bestand 3: xds.sh. Bash-script voor het maken van invoerbestanden voor het verwerken van wiggen door XDS vangegevens diffractie. Klik hier om dit bestand te downloaden. Normalelichtdoorlatingsfactor-bestand 4: xscale.sh. Bash script te diffractie gegevens uit deelverzamelingen samenvoegen en een HKL-bestand maken. Klik hier om dit bestand te downloaden. Normalelichtdoorlatingsfactor-bestand 5: ISigma.sh. Bash script te uittreksel van de ISigma-waarden van alle individuele deelverzamelingen. Klik hier om dit bestand te downloaden. Normalelichtdoorlatingsfactor-File 6: Rmeas.sh. Bash script te Rmeas waarden extraheren op basis van alle individuele deelverzamelingen. Klik hier om dit bestand te downloaden. Normalelichtdoorlatingsfactor-bestand 7: rotation_matrix.sh. Bash script te bereiden van het invoerbestand voor Matlab voor het berekenen van de Euler-hoeken uit de rotatie-matrix. Klik hier om dit bestand te downloaden.