العزلة وثقافة Microglia القوارض تعزيز دينامية تتفرع مورفولوجيا في المتوسط خالية من المصل
Summary
قد أعيقت الجهود المبذولة لفهم الدالة ميكروجليال بالتفصيل بعدم وجود نماذج الثقافة ميكروجليال أن الخص خصائص ناضجة في فيفو microglia. ويصف هذا البروتوكول نهج العزلة والثقافة تهدف إلى المحافظة على بقاء قوية من microglia الفئران الناضجة متشعب جداً في ظل الظروف المحددة والمتوسطة.
Abstract
Microglia تمثل 5-10% من جميع خلايا الجهاز العصبي المركزي (CNS) وهي تزداد لفت الانتباه نظراً لمساهماتها خلال التنمية، والتوازن، والمرض. على الرغم من أن قد درست بالتفصيل الضامة لعقود، وميزات متخصصة من microglia، الضامة المقيم في الأنسجة من الجهاز العصبي المركزي، فقد ظلت غامضة إلى حد كبير، جزئيا بسبب أوجه القصور في القدرة على تلخيص microglial ناضجة خصائص في الثقافة. نحن هنا، لتوضيح إجراءات واضحة لعزل السريع microglia نقية من الدماغ القوارض ناضجة. كما يصف لنا ثقافة خالية من المصل الظروف التي تدعم مستويات عالية من السلامة ميكروجليال على مر الزمن. معرض Microglia المزروعة تحت هذه الشروط المعرفة المتوسطة وضع العمليات متشعب ومراقبة ديناميكية السلوك. علينا توضيح بعض آثار التعرض للمصل على microglia مثقف ومناقشة كيف يمكن مقارنة هذه الثقافات خالية من المصل لكل الثقافات المعرضة للمصل، فضلا عن microglia فيفو.
Introduction
الضامة حمة الجهاز العصبي المركزي، microglia التفاعل مع مجموعة واسعة من الدوائر العصبية والشبكات مما يشير إلى الدبقية. أنها تلعب دوراً حيويا في التنمية والتوازن في الدماغ من خلال تشذيب متشابك وإزالة الخلايا أبوبتوتيك وتفاعلات عابرة مع العمليات العصبية1،2. Microglia هم أوائل المستجيبين للإصابات العصبية، توسيع نطاق عملياتها طويلة ورقيقة إلى مواقع الآفة لتنسيق الاستجابات التحريضية وتحد من النزيف3،4. التغييرات في مورفولوجيا microglial ووظيفتها في كل مكان في إصابات الجهاز العصبي المركزي الحادة والمزمنة، ومعرض microglia تتغير مورفولوجيا، والترجمة، والتعبير عن وسطاء التهابات في مجموعة متنوعة من الأمراض الدول1. وتشير الدراسات الجينية البشرية إلى أن الطفرات التي تغير من خطر الإصابة بأمراض الأعصاب وكثيراً ما يغلب أو حصرا يعرب عنها ميكروجليا في الجهاز العصبي المركزي سليمة، مشيراً إلى دور حاسم ل microglia في إمراضية المرض أو التقدم5 . ونظرا لشهرتهم في الإصابة والمرض، الفهم للبيولوجيا ميكروجليال أولوية عالية لتطوير النهج العلاجية الجديدة.
نشأت العديد من التطورات الهامة لفهم علم الأحياء ميكروجليال باستقراء التقنيات والآليات التي اكتشفت في الدراسات المتعلقة بالسكان بلعم الأخرى بما في ذلك تعريفات وظيفية وملامح التعبير الجيني وأساليب الثقافة /المورفولوجية الدول. على الرغم من أن تعميم بلعم وظائف غالباً ما تلعب بها بطرق مفاجئة داخل المشهد الجهاز العصبي المركزي، ميكروجليا هم أنفسهم درجة عالية من التخصص، نستعرض مورفولوجيا متشعب وتوقيع تعبير جينات فريدة أن مجموعات منهم إلى جانب غيرها من النسيج الضامة6. وقد Microglia نسب التي تختلف عن معظم الأنسجة الضامة؛ أنها استعمار في الجهاز العصبي المركزي خلال موجه جنينية مبكرة من هيماتوبويسيس البدائية وتجديد ذاتيا في جميع مراحل الحياة، مستقلة عن مساهمات نهائية هيماتوبويسيس7. توقيع التعبير الجيني ناضجة تماما من microglia الكبار لا يتحقق حتى بعد الولادة في الأسبوع الثاني8. منبهات البيئية من الأنسجة المحيطة دوراً رئيسيا في إملاء بلعم الأنسجة الخاصة ميزات6، التي تشمل التعرض المحدود لعوامل المنقولة بالدم الممنوحة من حاجز الدم في الدماغ9في الجهاز العصبي المركزي.
وهي عقبة واحدة لفهم كامل الاشتراكات ميكروجليال للتوازن في الجهاز العصبي المركزي والمرض صعوبة لخص الخصائص المتخصصة من microglia ناضجة ينظر في فيفو مع الخلايا المنقي في المختبر. تم تطوير العديد من الأساليب لعزل والثقافة microglia سليمة، ولكن معظم النهج المتبعة تعتمد على مصل لدعم بقاء الخلية. وقد أظهرنا أن إضافة مصل الدم، الذي هو طبيعته متغير كاشف التي تحتوي على مجموعة واسعة من الجزيئات النشطة بيولوجيا، وهي إشكالية بصفة خاصة عند العمل مع ميكروجليا لأنه يشجع مورفولوجيا أميبية، زاد انتشار، و غالباً ما ينظر البلعمه زيادة9 في فيفو عندما يتعرض microglia الدم تتحمل العوامل بعد تعطل حاجز الدم في الدماغ. بهذه المقاييس، تشبه الخلايا المعرضة للمصل microglia في الإصابة أو المرض الدول، ولكن خفضت هذه التعديلات عندما تستزرع microglia في المتوسطة النمو المحددة التي تحتوي على السائل الدماغي النخاعي-1 (أو إيل-34)، TGF-β، ونسبة الكولسترول في الدم، وسيلينيت.
يوفر هذا البروتوكول التفاصيل لاستزراع microglia الفئران الأحداث تحت ظروف خالية من المصل، المتصلة بالأعمال المنشورة مؤخرا9. هذا البروتوكول قد تم تبسيطها للفئران من يوم الولادة 21-30 (P21-P30)، ولكن يمكن تكييفها لعزل ميكروجليا من الفئران والجرذان في أي عمر، على الرغم من أن العائد والجدوى الشاملة سوف تختلف باختلاف الأنواع وسن الحيوان. الأعلى غلة وبقاء الأمثل يتحقق عند استخدام microglia قليلاً غير ناضجة (~ P9)، والغلات وجدوى مستدق تدريجيا إلى حد ما انخفاض مستويات في الحيوانات الكبار. ميكروجليا يمكن أيضا أن تكون معزولة من الفئران، ولكن وجدنا أن خلايا الفئران إظهار أعلى بكثير الغلات والجدوى، وتعقيد مورفولوجيس متشعب، عند مقارنتها بالماوس الخلايا في ثقافات خالية من المصل. الحيوانات أعمارهم أكبر من P50 لم يتم تقييمها مع هذا البروتوكول. وقد تم تحسين هذا الإجراء العزلة إيمونوبانينج لتقليل التغيرات في microglial النسخي التشكيلات الجانبية أثناء العزلة وإلى أقصى حد ممكن بقاء المتلقين للمعلومات من الخلايا. باستخدام هذه التقنيات والصياغات وسائل الإعلام، يمكن أن يستمر الثقافات العالية الجدوى الأولية لمدة أسابيع. يحمل مورفولوجيا متشعب جداً التي تنطوي على التوسع السريع وتراجع عمليات Microglia مثقف في ظل هذه الظروف ومعدلات انتشار منخفضة نسبيا. نحن تسليط الضوء على أهمية المصل-التعرض على هذه الخصائص، ومناقشة مواطن القوة والضعف لهذه الطريقة بالنسبة للطرق الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
لأنه بمثابة microglia الخلايا المناعية الحارس من الجهاز العصبي المركزي، فتستجيب للغاية للتغييرات البيئية؛ ولذلك، مطلوب قدر كبير من العناية لتقليل الاستجابات التحريضية داخل الخلايا أثناء عزلتها والثقافة8. ويتم ذلك في هذا البروتوكول من خلال السرعة ودرجة الحرارة. حفظ الخلايا على ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها كريستوفر ودانا ريف مؤسسة الدولية اتحاد البحوث المتعلقة بإصابات النخاع الشوكي، ميريام الدكتور وشيلدون زاي اديلسون مؤسسة البحوث الطبية، مؤسسة جبب، معهد البحوث الأساسية نوفارتيس، الحصول على مساهمات سخية من فنسنت وكوتس ستيلا، ومؤسسة أبحاث السرطان رونيون ديمون (DRG-2125-12).
Materials
| Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
| Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
| Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
| Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
| Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
| Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
| Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
| 11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
| Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
| Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
| Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
| Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
| Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stock reagents | |||
| Apo-transferrin | Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C |
||
| N-acetyl cysteine | Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
| Sodium selenite | Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C |
||
| Collagen IV | Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C |
||
| TGF-b2 | Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
| IL-34 | Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C |
||
| Ovine wool cholesterol | Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
| Heparan sulfate | Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
| Oleic acid/Gondoic acid | Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
| Heparin | Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C |
||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Perfusion Buffer | Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold |
||
| Douncing Buffer | Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold |
||
| Panning Buffer | Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
| Microglia Growth Medium (MGM) | Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. |
||
| Collagen IV Coating | Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
| Myelin Seperation Buffer | Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 |
||
| TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |
References
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).
- Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity. Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).
- Lou, N., et al. Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).
- Haynes, S. E., et al. The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides. Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
- Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages. Front Immunol. 6, 486 (2015).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. Myeloid Cells in the Central Nervous System. Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).
