Dissezione multiproteici segnalazione di purificazione di affinità di complementazione bimolecolare (BiCAP)

Assiemi complessi della proteina sono un processo chiave nel mantenimento della specificità spatiotemporal di molti segnalazione vie^1,2. Mentre la natura critica di questo ruolo normativo è ampiamente riconosciuta, c’è una mancanza di tecniche sperimentali disponibili a scrutare questi complessi. Maggior parte degli studi interattomica concentrarsi sulle interazioni con singole proteine, o l’arricchimento sequenza dei singoli componenti complessi. Qui presentiamo una tecnica per l’isolamento di un dimero di proteina specifica mentre escluse le moiety individuali di proteine componente, nonché complessi formati con associazione partner³in competizione. Abbiamo chiamato questa tecnica di purificazione di affinità complementazione bimolecolare (BiCAP), come esso è una combinazione di una precedentemente esistenti analisi di complementazione frammento della proteina, bimolecolare fluorescenza complementazione (BiFC), con l’uso novello di un nanobody ricombinante conformazione-specifici verso GFP e suoi derivati (vedere tabella materiali).

Un’analisi di complementazione del frammento proteico tipico si basa sull’espressione di proteine “esca” e “preda” fusa per dividere frammenti di giornalisti come luciferase⁴, β-galattosidasi⁵o la proteina fluorescente verde (GFP)⁶ ( Figura 1A). Attraverso l’interazione delle proteine esca e preda, i domini di reporter di Spalato sono incoraggiati a ripiegare in una struttura funzionale, consentendo l’interazione dell’esca e preda di proteine per essere visualizzati o quantificato. BiCAP è stato adattato da una versione di questa tecnica che ha fatto uso di frammenti della variante GFP Venus. Analisi di complementazione di proteina fluorescente sono un metodo popolare per la visualizzazione di interazioni proteina-proteina in una cellula viva, ma fino ad ora sono state limitate a questo una funzione⁷. BiCAP rappresenta un progresso significativo a questo proposito, come questa tecnica consente non solo per la visualizzazione, ma anche l’isolamento e interrogatori dell’interazione proteina-proteina risultante.

Figura 1: lo strutturale principale dietro la tecnica BiCAP. (A) uno schema che illustra il principale dietro mostrando complementazione bimolecolare fluorescenza le proteine ‘esca’ e ‘preda’ contrassegnati con il N-terminale V1 o V2 del C-terminale frammenti della proteina Venus full-length. (B) analisi strutturale di (ciano) l’interfaccia di interazione tra la GFP nanobody (verde) e Venere ricombinata, indicante la posizione delle V1 (grigio) e V2 (arancione) frammenti (PDB adesione 3OGO). Questa figura è ripubblicato fromCroucher et al.³ ristampato con il permesso di AAAS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

BiCAP tecnica fa uso di due frammenti non fluorescente di Venere (denominato V1 e V2) che associano un basso grado di affinità, a meno che non si verifica un’interazione tra i loro soci di fusione. In questo caso, i domini di due split ripiegare nella struttura funzionale del β-barilotto del fluoroforo (Figura 1B)⁶. L’innovazione chiave di BiCAP deriva dall’introduzione del ricombinante nanobody GFP, che riconosce un epitopo tridimensionale sul β-barilotto di GFP (e varianti come Venus) che è presente il fluoroforo correttamente ricombinato e piegato ( solo Figura 1B)⁸. Fondamentalmente, il nanobody GFP non viene associato a uno dei singoli frammenti di Venus. Questo facilita l’isolamento dei dimeri della proteina solo dopo che le due proteine hanno formato un complesso di loro spontanea volontà, portando a risultati più rappresentativi che quelle acquisite da metodi che fanno uso di interazioni chimicamente indotto, forzato⁹.

BiCAP è una tecnica potente che si concentra in particolare sui complessi della multi-proteina, che potenzialmente possono essere combinati con un numero di applicazioni a valle per migliorare il livello di dettaglio della nostra comprensione del ruolo che questi complessi svolgere nella trasduzione del segnale . Esso comprende anche la caratteristica importante di permettendo visualizzazione di proteine interazioni in situ. Ad oggi, BiCAP è stata dimostrata come un efficace metodo di analizzare Interactoma dei recettori tirosina chinasi (RTK) dimeri³, ma l’adattabilità di questo metodo significa che possa essere adottata in qualsiasi contesto di interazione della proteina.