Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

A barreira hemato – encefálica (BBB) consiste nas células endoteliais microvasculares (ECs), apoiadas por pericitos intimamente associados (PCs), que são ensheathed na lâmina basal, e astrócitos (ACs) que envolvem a membrana basal com os pés-final^{1 ,2}. ECs interagirem com vários tipos de células que suportam e regulam a função de barreira, principalmente ACs e PCs, e também os neurônios e microglia, que juntos formam a unidade neurovascular (NVU). O NVU é crítico para a função do BBB, que limita o transporte de sangue toxinas e patógenos de entrar no cérebro. Esta função é um resultado da junção apertada-moléculas como claudin-5, occludin, zonula occludens-1, que estão presentes entre o ECs e também devido à ação de transportadores como p-glicoproteína (P-gp) o efluxo moléculas que entram o endotélio de volta para o navio lúmen^1,2,3. O BBB entretanto permite o transporte de moléculas essenciais como nutrientes (glicose, ferro, aminoácidos) por transportadores específicos expressados no CE membranas de plasma^1,2,3. A camada de CE é altamente polarizada em relação a distribuição de vários transportadores entre o luminal (sangue-face) e abluminal (membranas voltados para o cérebro) para permitir o transporte específico e vectorial função^4,5 . Enquanto o BBB é protetor com relação a regulação firmemente no meio do CNS, é um grande desafio para a entrega de drogas CNS em doenças como a doença de Parkinson com um BBB funcional. Mesmo em doenças neurológicas com disfunção do BBB, ele não pode ser considerado que a entrega de drogas do cérebro é maior, particularmente como a disfunção da barreira poderia incluir danos para as metas de transporte específico por exemplo, como a doença de Alzheimer (AD). No anúncio, vários transportadores de amiloide beta, como o LRP1, raiva, P-gp são conhecidos por ser prejudicado e direcionamento, portanto, estes transportadores pode ser fútil^6,7,8. O BBB é prejudicado em várias doenças neurológicas como meningite de acidente vascular cerebral, AD, esclerose múltipla e tumores de cérebro^9,10,11. Restaurar a função de barreira é uma parte crucial da estratégia terapêutica e, portanto, sua avaliação é fundamental.

Neste trabalho, descrevemos um objectivo e quantitativo protocolo para ensaio de permeabilidade em roedores que nós aplicada com êxito a várias linhas de rato ambos doença transgénicos e experimental modelos^{10,12,13 ,14}. O método é baseado em uma simples injeção intraperitoneal de traçadores fluorescentes seguido de perfusão dos ratos para remover os marcadores do compartimento vascular. Cérebro e outros órgãos são coletados post perfusão e avaliados por um objectivo de permeabilidade e índice de permeabilidade absoluta com base nas medidas de fluorescência do tecido homogenates em um leitor de placa. Todos os valores de fluorescência crus são corrigidos para o plano de fundo usando o soro de animais de Souza que não recebem qualquer marcador ou tecido homogenates. Amplas normalizações são incluídas para o volume de soro, fluorescência de soro e o peso dos tecidos, produzindo assim o índice de permeabilidade absoluta e comparáveis entre as experiências e os tipos de tecido. Para facilitar a comparação entre os grupos, os valores de índice de permeabilidade absoluta podem ser prontamente transformados rácios como tinha anteriormente foram realizadas¹². Simultaneamente, armazenado hemi-cérebro e rim poderiam ser utilizados para visualização de traçador por microscopia de fluorescência¹⁰. A microscopia de fluorescência clássico pode ser valiosa na obtenção diferença regional na permeabilidade, embora complicado devido à seleção subjetiva de imagens para uma análise semi-quantitativa e seções do tecido. As etapas detalhadas são apresentadas no protocolo e notas são adicionadas quando necessário. Isto fornece as informações necessárias para executar com êxito o ensaio de permeabilidade em vivo nos ratos que podem ser escalados para outros pequenos animais. O ensaio pode ser aplicado a vários tipos de marcadores permitindo a carga e o tamanho com base em avaliação de permeabilidade por uma combinação de marcadores com espectros de fluorescência distintas.