Eencellige Photoconversion in levende Intact zebravis
Summary
Hier presenteren we een protocol om te laten zien hoe de photoconversion van de cel wordt bereikt door UV blootstelling aan specifieke gebieden uiten de fluorescente proteïne, Eos, in levende dieren.
Abstract
Dier- en plantensoorten weefsel is samengesteld uit verschillende populaties van cellen. Deze cellen communiceren na verloop van tijd te bouwen en onderhouden van het weefsel en kunnen leiden tot ziekte wanneer verstoord. Wetenschappers hebben ontwikkeld, slimme technieken om te onderzoeken van de kenmerken en de natuurlijke dynamiek van deze cellen binnen intact weefsel met het uitspreken van fluorescente proteïnen in subsets van cellen. Echter, soms experimenten vereisen meer geselecteerde visualisatie van de cellen in het weefsel, soms op de wijze van eencellige of bevolking-van-cellen. Om dit bereiken en visualiseren van afzonderlijke cellen binnen een bevolking van cellen, hebben wetenschappers eencellige photoconversion van fluorescente proteïnen gebruikt. Om aan te tonen deze techniek, zien we hier hoe directe UV-licht naar een Eos-uiten-cel van belang in een intact, zebravis wonen. We beeld dan die photoconverted Eos+ cellen 24 h later om te bepalen hoe ze veranderd in het weefsel. We beschrijven twee technieken: één cel photoconversion en photoconversions van de populaties van de cel. Deze technieken kunnen worden gebruikt om te visualiseren cel interacties, cel-lot en differentiatie en cel-migraties, waardoor het een techniek die geldt in veel biologische vragen.
Introduction
Meerdere afzonderlijke cellen samen bouwen en onderhouden van complexe dierlijke en plantaardige weefsels. Deze cellen zijn vaak tussenliggende en moeilijk te onderscheiden van buren op het niveau van een enkele cel zonder hoge resolutie microscopie waarvoor fixatie van weefsel. Echter, om te begrijpen hoe deze weefsels vormen, zijn gehandhaafd en worden zieke, is het essentieel om te onderzoeken hoe één cellen binnen het weefsel na verloop van tijd zijn interactie. Ideaal, deze experimenten vereisen de etikettering van enkelvoudige cellen binnen een weefsel op een niet-invasieve wijze zonder de vereiste bevestigingsmiddelen. Wetenschappers hebben nu talrijke technieken om te bereiken deze taak1,2,3,4ontwikkeld.
De ontdekking en de uitvoering van de kwallen groen fluorescente proteïne (GFP) was een opwindende benadering die toegestaan voor het labelen van afzonderlijke cellen in een weefsel milieu1. Met behulp van cel-specifieke initiatiefnemers, is het mogelijk genetisch selecteren een subset van cellen die zijn gemarkeerd met1. U kunt ook kan virale geïnduceerde expressie van GFP worden gebruikt voor gebruiker geselecteerde expressie van GFP3,4. Hoewel vrij nuttig, kan genetische gemedieerde uitdrukking van GFP geen gebruiker geselecteerde expressie binnen een subset van cellen in het weefsel; en virale uitdrukking van GFP, hoewel voordelige, kan invasieve. Met de komst van GFP derivaten en slimme technieken zoals zwHANSje uitspreken verschillende TL eiwitten meer dun in weefsels, het mogelijk geworden om te visualiseren van afzonderlijke cellen en de interacties tussen hen in complexe weefsel2, 5. echter deze benaderingen cellen in een willekeurige mode label. Als het gewenste experiment visualisatie van een enkele cel of een bevolking van cellen die is gedefinieerd door de experimentator nodig, zijn ze dus beperkt. Met dergelijke experimenten, zou het voordeel hebben van een genetisch uitgedrukt fluorescent proteïne die kan worden gemanipuleerd om te onderscheiden, in een enkele cel mode, van andere TL- en niet-belichting fluorescerende cellen.
De wetenschappelijke gemeenschap gebruikt voor het bereiken van dit doel en visualiseren van de celbiologie van afzonderlijke cellen binnen een complexe levend weefsel, eencellige photoconversion van verschillende fluorescente proteïnen6,7,8. Genetisch gereguleerde uitdrukking van een photoconvertible-eiwit (dat wil zeggen, eos, kaede, etc.) dat van een groen rood fluorescerende staat overgangen bij blootstelling aan UV (488 nm) licht, we kunnen een eencellige onderscheiden van haar fluorescently geëtiketteerde buren6,7,8. Deze aanpak maakt gebruik van een apparaat aangesloten op onze confocal microscoop die licht uit een laser stapel naar een diffractie-beperkte regio van belang direct kan. Met deze techniek kunnen we ofwel label afzonderlijke cellen of grotere populaties in een gebruiker gedefinieerde manier9,10,11. De techniek is een minimaal invasieve vergeleken met eencellige injecties van virale GFP. Als een bewijs van concept, laten we zien dat we photoconvert enige cellen binnen een ganglion in het perifere zenuwstelsel en de grotere populaties photoconvert als cellen gelegen aan de ventrale zijde van het ruggenmerg9,10kunnen, 11,12. Wij kunt vervolgens deze photoconverted cel populaties 24 h later om inzicht in hun beweging en differentiatie tijdens ontwikkeling visualiseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
In complexe weefsels organiseren verschillende celtypes in specifieke domeinen. Onlangs hebben technieken zijn gebruikt om de afzonderlijke cellen label binnen deze grote weefsel structuren1,2,3. Wij tonen hier twee technieken die kunnen ook worden gebruikt om het visualiseren van zowel eencellige interacties en cel bevolking interacties binnen complexe weefsels. Het voordeel van de photoconversion-techniek is de ruimtelijke con…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Bernard Kulemaka en leden van the Smith lab voor hun nuttige opmerkingen en de oriëntatie van de reagens, Sam Connell en Brent Redford van 3i voor imaging vragen en Deborah Bang, Karen Heed en Kay Stewart fielding zebrafish ziekenverpleger. Dit werk werd gesteund door de University of Notre Dame, de Elizabeth en Michael Gallagher Family, Alfred P. Sloan Foundation Center voor Zebrafish onderzoek aan de Universiteit van Notre en Center van de cellen van de stam en regeneratieve geneeskunde aan de Universiteit van Notre Dame. Alle dierlijke studies werden gedaan met inachtneming van de Universiteit van Notre Dame IACUC aan Dr. Cody Smith.
Materials
| Tg(sox10:eos) zebrafish animals | Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame | ||
| 100 X 15 mm petri dish | VWR | 25384-302 | |
| Embryo medium | Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock. | ||
| 0.8% Low Melting Point Agarose | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| Needle dissecting probe | |||
| 0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) | Fluka analytical | A5040-250G | |
| Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters | Zeiss Axiozoom | ||
| Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets | 3i spinning disk confocal | ||
| UV light source (laser) for photoconversion | 405 nm laser | ||
| Slidebook software | 3i | ||
| Methylene blue | Kordon |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
- Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
- Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
- Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
- McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
- Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).
- Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
- Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).
