JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
유전학

İnsan revers transkriptaz protein RNA'ya bağımlı RNA polimeraz aktivitesinin yarı kantitatif algılama

Published: June 12, 2018
doi:
10.3791/57021
, , , ,
1Division of Cancer Stem Cell,National Cancer Center Research Institute

Summary

İnsan revers transkriptaz (TERT) hem de çift iplikçikli RNA RNA’ya bağımlı RNA polimeraz faaliyetleri ile telomeric DNA sentezler. Burada, RNA’ya bağımlı RNA polimeraz etkinliği endojen TERT algılamak için yeni kurulan bir tahlil açıklayın.

Abstract

İnsan revers transkriptaz (TERT) Revers katalitik altbirim telomer RNA’ya bağımlı DNA polimeraz faaliyetleri ile hisli var… TERT transkriptaz adlandırılır rağmen TERT yapısal ve Filogenetik analiz TERT sağ elini polimerazlar bir üyesidir ve viral RNA’ya bağımlı RNA polimeraz (RdRPs) viral transkriptaz yanı sıra ilgilidir göstermek. Biz öncelikle tamamlayıcı RNA oluşturur insan TERT aktivitesinin RNA kodlamayan şablon için stand ve kanser hücrelerinde susturmak RNA katkıda RdRP tespit edilmiştir. Bu kanonik olmayan enzimatik etkinliğini çözümlemeye RdRP tahlil rekombinant TERT ile 2009 yılında geliştirilen, bundan sonra vitro RdRP tahlil için endojen TERT kurmuştur. Bu makale, ikinci yöntemi açıklanmaktadır. Kısaca, TERT bağışıklık kompleksleri hücreleri izole ve şablon RNA ve radyoaktif rNTP RdRP tepki için de dahil olmak üzere rNTPs ile inkübe. Tek iplikçikli RNA ortadan kaldırmak için reaksiyon ürünleri ben ve son ürünlerin polyacrylamide jel elektroforez ile analiz edilir RNase ile tedavi edilir. Radiolabeled RdRP ürün autoradiography tarafından gece maruz kaldıktan sonra tespit edilebilir.

Introduction

İnsan revers transkriptaz (TERT) iyi bilinen Revers katalitik alt birim ve Revers RNA bileşeni (TERC), belirli RNA şablon1kullanarak telomer uzatıyor. TERT telomeric DNA Revers bir bileşeni olarak polymerizes rağmen yapısal ve filogenetik Analizi TERT gibi viral transkriptaz viral RNA’ya bağımlı RNA polimeraz (RdRPs) ile yakından ilgilidir ve etki ile paylaşan gösterir Bu polimerazlar2,3,4. RdRP RNA iplikçik bir şablona RNA oluşturur enzimdir. Enzim sadece virüs ama aynı zamanda model organizmalar, bitki, mantar ve solucan gibi kodlanır ve çift iplikçikli RNA sentezi RdRP tarafından bu organizmalar5‘,6 transkripsiyon ve çoğu gen susturmak için katkıda bulunur . Her ne kadar insan RdRP uzun zamandır kayıptı, insan TERT 20097RdRP aktivite bulduk.

İlk Rekombinant protein7ile TERT RdRP etkinliğini doğruladı sonra RdRP aktivite endojen TERT8algılamak için bir hassas vitro tahlil kurulan. Burada, endojen TERT vitro RdRP tahlil (IP-RdRP tahlil) göstermektedir. Bu yöntem endojen TERT immunoprecipitation (IP) ile başlar ve vitro RdRP tepki, radyoaktif ribonucleotides doğmakta olan RNA iplikçikler halinde dahil edilmiştir gelir.

Protocol

1. reaktif Kur Hücre eşitleme için kullanılan reaktifler Dulbecco’nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM) 2.5 mM timidin içeren üretmek için doku kültürü sınıf su 125 mM timidin hazırlamak için 1 mL başına timidin 30.28 mg geçiyoruz. Çözüm 0,22 mikron şırınga filtre birimi olan filtrate. 1 mL taze hazırlanmış 125 mM timidin % 10 (vol/vol) fetal Sığır serum ile (FBS) takıma DMEM 50 mL başına ekleyin. 0,1 μg/mL nocodazole içeren DMEM üretmek için dimetil sülfoksit (5 μg/μL nocodazole hazırlamak için DMSO) nocodazole geçiyoruz. 5 µg 1 µL Ekle / µL nocodazole DMEM 50 mL başına % 10 (vol/vol) FBS ile desteklenmiştir. DMSO %0,002 (vol/vol) içeren DMEM üretmek için DMSO 1 µL % 10 (vol/vol) FBS ile desteklenmiş DMEM 50 mL başına ekleyin. IP-RdRP tahlil için kullanılan reaktifler Lizis arabellek A: 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) hazırlamak ve %0,5 (vol/vol) Nonidet P-40 (NP-40). Reaktif 4 ° C’de depolayın 5 x asetat arabellek hazırlamak: 50 mM 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic asit (HEPES)-KOH (pH 7.8), 500 mM potasyum asetat ve 20 mM MgCl2. Reaktif oda sıcaklığında saklayın. Hazırlamak yıkama arabellek 1: 1 x asetat arabellek, % 10 (vol/vol) gliserol, % 0,1 (vol/vol) Triton X-100 ve 0,06 x proteaz inhibitörü kokteyl, ethylenediamenetetraacetic asit (EDTA)-ücretsiz. Yıkama arabellek 1 gün kullanım ya da gün kullanmadan önce hazırlamak. Reaktif 4 ° C’de depolayın AGC çözüm hazırlamak: 1 x asetat arabellek, % 10 (vol/vol) gliserol ve %0.02 (wt/vol) 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonat (çocuklar). Reaktif 4 ° C’de depolayın 2 mM CaCl2içeren AGC çözüm üretmek için 100 µL 1 M CaCl2 50 mL AGC çözeltisi ekleyin. Reaktif 4 ° C’de depolayın 3 mM etilen glikol bis (b-aminoethylether) içeren AGC çözüm üretmek için-N, N, N’, N’-tetraacetic asit (EGTA), 0.4 M EGTA (pH 7.5) 375 µL başına 50 mL AGC çözeltisi ekleyin. Reaktif 4 ° C’de depolayın Yıkama arabellek 2: 1 x asetat arabellek ve %0.02 (wt/vol) çocuklar hazır olun. Reaktif 4 ° C’de depolayın HMD çözüm hazırlamak: 0,2 M HEPES-KOH (pH 7.8), 40 mM MgCl2 ve 2 mM dithiothreitol (DTT). Mağaza-20 ° C’de reaktifNot: HMD çözüm en az üç ay içinde yenilenmelidir. 2 x İndinavir K arabellek hazırlamak: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM EDTA ve %1 (wt/vol) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS). Mağaza-20 ° C’de reaktif Arabellek yükleme x 2 hazırlamak: (vol/vol) formamide, 20 mM EDTA ve %1 (wt/vol) turuncu G. saklamak-20 ° C’de reaktif 2. HeLa hücreleri hazırlanması Not: HeLa hücreleri hazırlamak eş zamanlı mitotik faz (manipüle) veya zaman uyumsuz olarak bölme (unmanipulated). Varlığında % 5 CO2 37 ° C’de hücreler kültür Eşitleme HeLa hücreleri mitoz Plaka 1 x 106 HeLa hücreleri ile 10 mL % 10 (vol/vol) 10 cm kültür tabak içinde FBS ile takıma DMEM. İki gün sonra kaplama, orta 10 mL 2.5 mM timidin ve % 10 (vol/vol) FBS içeren DMEM ile değiştirin. 24 h için hücreleri kültür. Hücreleri üç kez 10 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) (-) ile yıkama ve 10 mL % 10 (vol/vol) FBS 6 h için içeren DMEM hücrelerle kültür. Orta nocodazole ve % 10 (vol/vol) FBS 0.1 µg/mL içeren DMEM 10 mL ile değiştirin ve 14 h için hücreleri kültür. Kültür çanak yavaşça salla ve müstakil Mitotik hücre içeren süpernatant almak. IP-RdRP tahlil için hücre saymak. 490 x g 4 ° C’de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.Not: Hücre Pelet-80 ° C’de saklanabilir Unmanipulated HeLa hücreleri hazırlanması Plaka 1 x 106 HeLa hücreleri ile 10 mL % 10 (vol/vol) 10 cm kültür tabak içinde FBS ile takıma DMEM. İki gün sonra kaplama, orta 10 mL % 10 (vol/vol) FBS içeren DMEM ile değiştirin. 30 h için hücreleri kültür. Orta %0,002 (vol/vol) DMSO ve % 10 (vol/vol) FBS içeren DMEM 10 mL ile değiştirin ve 14 h için hücreleri kültür. Hücreleri tarafından 0.7 mL 1 mM EDTA içeren tripsin (2.5 g/L) kullanarak trypsinization toplamak. IP-RdRP tahlil için hücre saymak. 490 x g 4 ° C’de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.Not: Hücre Pelet-80 ° C’de saklanabilir 3. IP-RdRP tahlil Protein A-özel boncuk hazırlık 1 mL (yatak hacmi 500 µL) 1.5 mL microcentrifuge tüp benzeşme reçine aktarın. Vasıl 800 x g 4 ° C’de 5 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Lizis arabelleği A 800 µL boncuk için ve de tüp birkaç kez ters çevirme ile karıştırın. Vasıl 800 x g 4 ° C’de 3 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Bu iki kez (Toplam üç yıkama) tekrarlayın. İyi tüp birkaç kez ters çevirme tarafından karıştırın, lizis arabelleği A 800 µL boncuk için ekleyin. Tüp 4 ° c üzerinde döner bir shaker gecede (veya en az 4 h için) döndürün. Tüp vasıl 800 x g 4 ° C’de 3 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Lizis arabelleği A 500 µL boncuk için ve de tüp birkaç kez ters çevirme ile karıştırın. Boncuk 4 ° C’de depolayın Hücre lysate hazırlanması (İsteğe bağlı) Hücreler 2. adımda donduruldu varsa yerleştirebilir ve hücreler gevşek olana buz dondurulmuş hücrelerdeyse çözülme. Hücreleri bir kez PBS (-) 10 mL ile yıkayın. 1.450 x g 4 ° C’de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Buz gibi lizis arabellek (1 mL) lizis arabelleği 1 x 107 hücrelerin A hücrelerle nazik pipetting tarafından parçalayıcı. Aşağıdaki koşullar ile 1,5 mL tüp örnekte solüsyon içeren temizleyicide; ayarla sonicator amplifikasyon % 25 ve 10 için solüsyon içeren temizleyicide s. Örneği ‘ 20,400 x g 4 ° C’de 15 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant toplamak. 1 mL her süpernatant 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine aktarın.Dikkat: RNase free koşullar altında tüm yordamları gerçekleştirin. Immunoprecipitation 3.2.6. adımdaki lysate 40 µL (boncuk Cilt 20 µL) ekleyerek alışım protein A-özel boncuk lysate 1 mL başına önceden temizleyin. İyi tüp birkaç kez ters çevirme tarafından mix ve örnek 4 ° C’de 30 dk için döndürme 13.000 x g 4 ° C’de 1 dk. için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant kurtarmak. 40 µL (yatak hacmi 20 µL) alışım protein A-özel boncuk ve anti-insan TERT antikor 10 µg ekleyin (klon: 10E9-2)8 önceden temizlenmiş içine lysate. İyi tüp birkaç kez ters çevirme tarafından mix ve örnek 4 ° c gece boyunca döndürmek. 3300 x g 4 ° C’de 0,5 dk için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın. Boncuk yıkama arabelleği 1 ile yıkayın: yıkama arabellek 1 1 mL için boncuk ekleyin, karıştırın de tüp ters çevirme tarafından ve örnek 4 ° C’de 5 min için döndürme 3300 x g 4 ° C’de 0,5 dk için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın. Bu üç ek kez tekrarlayın. Boncuklar, bir kez 2 mM CaCl2içeren AGC çözüm ile yıkayın: AGC çözüm 2 mM CaCl2 boncuk için içeren 1 mL ekleyin, karıştırın de tüp ters çevirme tarafından ve örnek 4 ° C’de 5 min için döndürme 3300 x g 4 ° C’de 0,5 dk için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın. Boncuk Micrococcal nükleaz (MNase) ile tedavi: Tablo 1′ de açıklanan MNase reaksiyon karışımı hazırlayın. Boncuk MNase reaksiyon karışımı 60 µL içinde nazik pipetting tarafından resuspend. Örnek hafifçe bir pikap Peltier tipi kuluçka 25 ° C’de 15 dakika ayarla bir shaker üzerinde (20-25 rpm) sallamakNot: Dalgalı bir shaker kullanıp kesinlikle hız sınırı Bu adımda takip etmek çok önemlidir. Çalkalayıcılar, dönen mikserler gibi diğer tür tavsiye edilmez. 3300 x g 4 ° C’de 0,5 dk için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın. Boncuk iki kez 3 mM EGTA içeren AGC çözüm ile yıkayın: AGC çözüm 3 mM EGTA boncuk için içeren 1 mL ekleyin, karıştırın de tüp ters çevirme tarafından ve örnek 4 ° C’de 5 min için döndürme 3300 x g 4 ° C’de 0,5 dk için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın. Bir kez bu adımı yineleyin. Boncuk bir kez yıkama arabelleği 2 ile yıkayın: yıkama arabellek 2 1 mL ekleyinboncuk için mix de tüp ters çevirme tarafından ve örnek 4 ° C’de 5 min için döndürün 3300 x g 4 ° C’de 0,5 dk için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın. Buz üstündeki RdRP reaksiyonu ayarlanırken tutun.Dikkat: RNase free koşullar altında tüm yordamları gerçekleştirin. RdRP tepki RdRP reaksiyon karışımı yeni bir tüp Tablo 2′ de açıklandığı şekilde hazırlayın. [α -32P] 6 µL eklemek UTP (3.000 CI/mmol) karışımı ve de pipetting tarafından mix.Not: [α -32P] ATP, [α -32P] CTP veya [α -32P] GTP [α -32P] yerine tepki için kullanılabilir UTP. 1 µL şablonunun RNA ekleyin (1 µg/µL) karışımı ve de pipetting tarafından mix.Not: aşağıdaki RNA şablon RdRP tahlil oluşturmak için önerilir: 5′-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3’ 9. 3.4.3. adımdaki RdRP reaksiyon karışımı 20 µL ile boncuk pipetting tarafından resuspend. Örnek hafifçe bir pikap türü peltier kuluçka 32 ° C’de 2 h için ayarla bir shaker üzerinde (20-25 rpm) sallamak 5.4 µL İndinavir k (20 mg/mL) ve 2 x İndinavir K arabelleği 45,4 µL tepki karışıma ekleyin. Pipetting tarafından mix ve Peltier tipi kuluçka 37 ° C’de 30 dk için ayarla bir pikap üzerinde örnek (20-25 rpm) sallamak Su RNase free 109.2 µL örnek için ekleyin. Asit fenol kloroform 200 µL örnek için ekleyin. Gönderen de vortex mix ve 21,100 x g oda sıcaklığında 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi. Sulu faz için yeni bir tüp aktarın. Bir kez bu adımı yineleyin. 3 M sodyum asetat 20 µL ekleyin (pH = 5,2), 4 µL yağış taşıyıcı ve etanol sulu faz için 250 µL. Karıştırma için iyi tüp sallamak, sonra 21,100 x g 4 ° C’de 20 dk için de örnek santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak. Pelet 300 µL-20 ° C’de depolanan soğuk % 70 (vol/vol) etanol ile yıkayın Örneği ‘ 21,100 x g 4 ° C’de 15 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant atın ve Pelet kuruması.Dikkat: RNase free koşullar altında tüm yordamları gerçekleştirin.Not: Adım 3.4.11 Pelet-20 ° C’de en az 2 gün saklanabilir. RNase tedavi Pelet kimden adım 3.4.11 20 µL RNase free su resuspend. RNase tepki karışımı yeni bir tüp Tablo 3’ te açıklandığı şekilde hazırlayın. Örnek için 180 µL RNase tepki karışımı ekleyin ve 37 ° C’de 2 h için tüp kuluçkaya (Vol/vol) % 10 SDS 2.3 µL için örnek eklemek ve 37 ° C’de 15 dakika kuluçkaya 2 µL İndinavir k (20 mg/mL) için örnek eklemek ve 37 ° C’de 15 dakika kuluçkaya Asit fenol kloroform 205 µL örnek için ekleyin. Mix de tarafından girdap, sonra 21,100 x g oda sıcaklığında 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi. Sulu faz için yeni bir tüp aktarın. 3 M sodyum asetat (pH 5.2), yağış taşıyıcı 4 µL ve etanol sulu faz için 250 µL 20 µL ekleyin. Karıştırma için iyi tüp sallamak, sonra 21,100 x g 4 ° C’de 20 dk için de örnek santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak. Pelet 300 µL-20 ° C’de depolanan soğuk % 70 (vol/vol) etanol ile yıkayın Örneği ‘ 21,100 x g 4 ° C’de 15 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant atın ve Pelet kuruması.Not: Adım 3.5.9 Pelet-20 ° C’de en az 2 gün süreyle saklanabilir. Jel Elektroforez ve autoradiography Örnek 20 µL RNase free su ile resuspend. Arabellek yükleme x 2 20 µL ekleyin. Örnek 95 ° C’de 10 dakika kaynatın Buz üzerinde örnek ezmek. Jel çalıştırın. (Ayrıca bkz: adım 3.4.3) 34 nts şablon boyutu olması durumunda, 7 M üre – polyacrylamide jel jel elektroforez denaturing için kullanılır. Bir jel kurutma makinesi ile jel kuru. Kurutulmuş jel-80 ° C’de kuvvetlenmesine bir ekran ile bir X-ray kaset içinde film maruz

Representative Results

Önerilen RNA şablonuyla radyoaktif RdRP ürünler özellikle HeLa hücreleri mitotik aşamasında gece pozlama (Şekil 1A) sonra 20-30 nükleotit (nt) arasında gözlenir. Genellikle, sinyal şiddeti RdRP ürünlerin yaklaşık 25 konumlandırılmış iki pik gösterir nt ve 30 nt ürün boyut dağılımı ile ahenk içinde sonraki nesil sıralama9tarafından onaylandı. Mitotik hücre aksine HeLa hücreleri eşitleme olmadan neredeyse 20-30 nt radyoaktif ürünler yokluğu göstermektedir. 20 altında yerleştirilen oval sinyalleri, tüm örnekleri, NT’de vardır nonspesifik sürüklenir. Bu sadece bir ~ 30 nt ürünüyle mitotik HeLa hücreleri sinyali zayıf olması durumunda, RdRP tepki iyi gitmedi gösterir. MNase tedavi kabaca ve uygunsuz bir şekilde gerçekleştirilirse, örneğin, mitotik HeLa sinyal şiddeti azalır önemli ölçüde hücreleri (Şekil 1B). Eski HMD çözüm ile gerçekleştirilen RdRP reaksiyon da ürünleri (Şekil 1 c) azaltır. Resim 1 : Mitotik HeLa hücrelerde endojen TERT ürünlerin temsilcisi RdRP. IP-RdRP tahlil HeLa hücreleri (A) üç temsilcisi sonuçlarını nocodazole (manipüle) veya (unmanipulated) DMSO ile tedavi. Kimyasal Sentez 34 nt RNA şablon olarak kullanıldı. (B) IP-RdRP tahlil mitotik HeLa hücreleri ile uygun olmayan MNase tedavisi uygulandı. (C) IP-RdRP tahlil taze ya da eski HMD çözüm ile gerçekleştirilen mitotik HeLa hücreleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Reaktifler Birim Micrococcal nükleaz, 20 U/µL 1 ΜL Micrococcal nükleaz tampon, 10 x 8 ΜL Su RNase free 51 ΜL Tablo 1: MNase reaksiyon mix bileşeni. Reaktifler Birim Çocuklar, % 0.07 (wt/vol) 6 ΜL HMD çözüm 2 ΜL rATP, 80 mM 0.5 ΜL rGTP, 8 mM 1 ΜL rUTP, 0.4 mM 1 ΜL rCTP, 8 mM 1 ΜL RNase inhibitörü, 40 U/µL 0.5 ΜL Su RNase free 1 ΜL Tablo 2: RdRP reaksiyon mix bileşeni. Reaktifler Birim RNase bir ribonükleaz, 10 U/µL 0.2 ΜL Reaksiyon tampon, 10 x 20 ΜL Su RNase free 159.8 ΜL Tablo 3: Ribonükleaz tepki mix bileşeni.

Discussion

IP-RdRP tahlil insan TERT RdRP etkinliğini algılamak için duyarlı bir yöntemdir. TERT protein yüksek mitotik HeLa hücreleri TERT RdRP karmaşık8,9,10formlar ifade edilir. Bu mitotik HeLa hücreleri RdRP bir etkinlik tespit için en uygun bir malzeme olduğunu göstermektedir. Yukarıda açıklanan iletişim kuralında, mitotik ve sigara senkronize HeLa hücreleri olumlu ve olumsuz bir örnek sırasıyla dahil edilir. Şekil 1Aile gösterildiği gibi RdRP tahlil ürünleri mitotik HeLa hücreleri içinde önerilen RNA şablondan 20 ile 30 arası geniş radyoaktif sinyalleri göstermek nt. HeLa hücreleri ek olarak, biz tahlil hücre hatları farklı tipleri ile gerçekleştirilen ve sinyal örneği farklı hücre türleri9‘ değiştirilebilir bulundu: bazı güçlü sinyal sadece yaklaşık 30 göstermek nt, bazı HeLa hücreleri ile benzer bir yol göstermek. Biz de tahlil dışında 34 nt şablon8, RNA şablonlarla kısa gerçekleştirdik ve uzun (~ 300 nt) RNA’ların çeşitli serileri ile ve başarıyla elde RdRP ürünleri bu şablonlardan olabilir, ancak bazı tercihi. İlk deneme için ancak, HeLa hücreleri mitotik faz ve 34 nt RNA şablon kullanmanızı öneririz. RdRPs çift iplikçikli RNA astar bağımlı hem bir astar bağımsız şekilde11de oluşturabilirsiniz. TERT bu özelliği insan RdRP7,9olarak korur bildirdin; TERT dsRNA 3′-foldback yapısı ile arka astar mekanizması7ile bir RNA şablondan sentezler. 34 nt RNA şablon olarak TERT tamamlayıcı iplikçikleri astar9kullanmadan sentezler. Özellikle sentezlenmiş bir astar bağımsız şekilde, yani de novo sentezlenmiş RNA ürünleri, [α –32P] RdRP ürünleri algılamak için NTP [γ –32ile P] değiştirilebilir NTP RdRP reaksiyon9.

TERT bağışıklık kompleksleri boncuk üzerinde tedavisinde MNase istenilen sonuca ulaşmak için kritik bir adımdır. MNase tedavisi çok uzun ya da yoğun sallayarak ile gerçekleştirilirse, RdRP ürünleri son derece azalacaktır. Böyle bir sorun önlemek için kesinlikle protokol dikkatle takip için önerilir. HMD çözüm başarı için başka bir önemli faktördür. Sinyalleri çok zayıf olduğunu görürseniz, yeni hazırlanan bir HMD çözüm değiştirin.

Boyunca protokolünün, bir RNase kirlenmesini önlemek için büyük bir özenle almalıdır. Ribonükleaz tedavi özel ekipman ile yapılmalıdır. Ribonükleaz manipüle sonra bir ipuçları atmak ve RNase tüplerini hemen, RNase özel çözüm ile (Örneğin RNase sessiz) ortadan kaldırmak ve bahçeleri değiştirin.

TERT sadece TERC ama endojen RNA’ların da birçok türde ile etkileşim ve onların bir parçası7bildirdin. Değişiklik olmadan MNase tedavi, IP-RdRP tahlil gibi IP-RdRP tahlil endojen RNA şablonlarının TERT ilişkili RdRP etkinliği ve bioinformatic Kılavuzu için tam bir listesi üzerinde onların sırası özellikleri sağlar. Bu iletişim kuralı başarıyla doku lysate başvurdum. TERT normal ve tümör doku çeşitli ifade edilir çünkü bu tahlil TERT kanonik olmayan enzimatik işlevi insan araştırmak yararlı olabilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser kısmen proje tarafından kanser tedavi (P-doğrudan) (15cm0106102h0002, km) ve proje üzerinde yenilikçi araştırma geliştirme için kanser araştırma ve tedavi evrim (P-oluşturma) (16 cm 01061150001, km) için Japonya ajansından desteklenmiştir Tıbbi araştırma ve geliştirme, AMED için; Takeda Bilim Vakfı (Y.M.); Grant Prenses Takamatsu kanser araştırma fonu (13-24520, Y.M.); ve JSP’ler KAKENHI Grant numarası JP16K07133 (Y.M.).

Materials

Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Wako 044-29765
Fetal bovine serum (FBS) CORNING 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin mixed solution nacalai tesque 26253-84
Trypsin-Ethylenediamenetetraacetic acid (EDTA) solution nacalai tesque 32777-44
Phosphate buffered saline (PBS(-)) Wako 166-23555
Thymidine nacalai tesque 07147-61
Nocodazole Sigma M1404
Dimethyl sulfoxide (DMSO) nacalai tesque 08904-85
Sodium chloride nacalai tesque 31333-45
Tris(hydroxymethyl)aminomethane nacalai tesque 35434-21
Hydrochloric acid nacalai tesque 18321-05
Nonidet P-40 (NP-40) nacalai tesque 25223-04
Pierce Protein A Plus Agarose Thermo scientific 22812
2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) nacalai tesque 17514-15
Potassium hydroxide Wako 168-21815
Potassium acetate nacalai tesque 28405-05
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H2O) Wako 135-00165
Glycerol nacalai tesque 17045-65
Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether (Triton X-100) Wako 169-21105
cOmplete, EDTA-free Roche Applied Science 11 873 580 001
Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H2O) nacalai tesque 06731-05
Micrococcal nuclease (MNase) Takara Bio 2910A
Ethylene glycol bis (b-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) nacalai tesque 15214-92
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS) nacalai tesque 07957-64
Dithiothreitol (DTT) nacalai tesque 14128-91
rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM each Promega E6000
[a-32P]UTP (3,000 Ci/mmol) PerkinElmer NEG507H Use fresh RI for the assay
RNase inhibitor TOYOBO SIN-201
Proteinase K Takara 9033
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Life Technologies AM9720
3 M Sodium acetate NIPPON GENE 316-90081
Ethanol (99.5) nacalai tesque 14713-95
Dr. GenTLE Precipitation Carrier Takara Bio 9094
RNase One Ribonuclease Promega M4265
Sodium dodecyl sulfate (SDS) nacalai tesque 02873-75
Formamide, deionized nacalai tesque 16345-65
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (EDTA) nacalai tesque 15130-95
Orange G nacalai tesque 25401-22
CO2 incubator e.g., ASTEC SCA-325DRS
Centrifuge e.g., TOMY EX-135 For step B)
Micro refrigerated centrifuge e.g., KUBOTA 3740 For step 6.2
Sonicator Qsonica Q125 Set a microtip (#4422) on the sonicator, for step 6.4
Micro refrigerated centrifuge e.g., TOMY MX-305 For step 6.5
Cooled incubator e.g., Panasonic MIR-154-PJ Set a rotary shaker inside
Rotary shaker e.g., TAITEC RT-5
Cooled incubator  e.g., TAITEC BR-43FL Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 7.7
MINI WAVE AS ONE WEV-03 A shaker for steps 7.7, 8.5 and 8.6
Incubator e.g., TAITEC HB-80 Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 8.5 and 8.6
Block incubator e.g., ASTEC BI-516S
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martinez, P., Blasco, M. A. Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins. Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).
  2. Nakamura, T. M., et al. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science. 277 (5328), 955-959 (1997).
  3. Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).
  4. Salgado, P. S., et al. The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription. PLoS Biol. 4 (12), e434 (2006).
  5. Castel, S. E., Martienssen, R. A. RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond. Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).
  6. Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., Grewal, S. I. RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 152-157 (2005).
  7. Maida, Y., et al. An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA. Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).
  8. Maida, Y., et al. Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance. Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).
  9. Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase. Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).
  10. Okamoto, N., et al. Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).
  11. van Dijk, A. A., Makeyev, E. V., Bamford, D. H. Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization. J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).

Tags

RNA-dependent RNA PolymeraseTERTRNA BiologyRdRP ActivityHeLa CellsCell LysisImmunoprecipitationProtein PurificationMicrococcal NucleaseSemi-quantitative Detection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Maida, Y., Yasukawa, M., Ghilotti, M., Ando, Y., Masutomi, K. Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein. J. Vis. Exp. (136), e57021, doi:10.3791/57021 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image