كشف شبه كمي النشاط المعتمدة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الحمض النووي الريبي للبروتين البشري Telomerase المنتسخة العكسية
Summary
Telomerase البشرية عكس المنتسخة (ثالثي) توليف الحمض النووي تيلوميريك ليس فقط، بل أيضا الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل من خلال نشاط تعتمد على الحمض النووي الريبي بوليميراز الرنا. وهنا يصف لنا مقايسة المنشأة حديثا للكشف عن نشاط تعتمد على الحمض النووي الريبي بوليميراز الرنا ثالثي الذاتية.
Abstract
Telomerase البشرية عكس المنتسخة (ثالثي) هو وحدة فرعية الحفاز من تيلوميراسي، وأنها الغضروفي telomere من خلال نشاط تعتمد على الحمض النووي الريبي بوليميراز الدنا. على الرغم من أن يدعى ثالثي المنتسخة العكسية، يثبت تحليلات الهيكلية والنشوء والتطور لمادة ثالثي عضو اليد اليمنى [بولمرس]، وتتصل الفيروسية تعتمد على الحمض النووي الريبي رنا بولمرس (ردربس) فضلا عن الفيروسية عكس المنتسخة. وقد حددنا أولاً RdRP نشاط ثالثي البشرية التي تولد رنا مكملة الوقوف إلى قالب غير الترميز الجيش الملكي النيبالي ويسهم في الجيش الملكي النيبالي إسكات في الخلايا السرطانية. لتحليل هذا النشاط الأنزيمي غير متعارف عليه، نحن نمواً الإنزيم RdRP مع ثالثي المؤتلف في عام 2009، وبعد ذلك أنشأت في المختبر بالانزيم RdRP ثالثي الذاتية. في هذه المخطوطة، يصف لنا طريقة الأخيرة. بإيجاز، مجمعات محصنة ثالثي المعزولة من الخلايا، والمحتضنة مع قالب الجيش الملكي النيبالي، ورنتبس بما في ذلك رنتب المشعة لرد فعل RdRP. للقضاء على الجيش الملكي النيبالي واحد-الذين تقطعت بهم السبل، تعامل نواتج التفاعل مع رناسي الأول، والمنتجات النهائية ويتم تحليل مع جل polyacrylamide التفريد. ويمكن الكشف عن راديولابيليد RdRP المنتجات التي أوتوراديوجرافي بعد التعرض بين عشية وضحاها.
Introduction
Telomerase البشرية عكس المنتسخة (ثالثي) المعروف جيدا كوحدة فرعية الحفاز من تيلوميراسي، وأنها الغضروفي telomere استخدام قالب الحمض النووي الريبي محددة1telomerase الجيش الملكي النيبالي المكون (ترك)،. على الرغم من أن مادة بوليميريزيس تيلوميريك الحمض النووي كعنصر من عناصر تيلوميراسي، التحليل الهيكلي والنشوء والتطور تشير إلى أن ثالثي ارتباطاً وثيقا مع الفيروسية تعتمد على الحمض النووي الريبي رنا بولمرس (ردربس)، فضلا عن المنتسخة العكسية الفيروسية، وتشاطر المجالات مع هذه بولمرس2،،من34. RdRP هو الإنزيم الذي يولد حبلا الحمض النووي الريبي مكملة لقالب الجيش الملكي النيبالي. يتم ترميز الإنزيم ليس فقط في الفيروسات ولكن أيضا في نموذج الكائنات، مثل النباتات والخميرة والدودة، وتوليف الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل التي RdRP يساهم في إسكات الجينات النسخي وبوستترانسكريبشونال في هذه الكائنات الحية5،6 . على الرغم من أن RdRP البشرية كانت مفقودة منذ فترة طويلة، نحن وجدنا نشاط RdRP ثالثي البشرية في 20097.
أولاً أكد RdRP نشاط ثالثي مع البروتين المؤتلف7، ثم أنشأت مقايسة حساسة في المختبر للكشف عن النشاط RdRP الذاتية ثالثي8. هنا، علينا أن نظهر في المختبر RdRP المقايسة (مقايسة الملكية الفكرية-RdRP) لمادة الذاتية. هذا الأسلوب يبدأ مع إيمونوبريسيبيتيشن (IP) من مادة الذاتية، وتبعتها في المختبر رد RdRP، التي تدمج ribonucleotides المشعة خيوط الحمض النووي الريبي الوليدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
مقايسة RdRP الملكية الفكرية أسلوب حساسة للكشف عن النشاط RdRP من البشر ثالثي. وأعرب عن البروتين ثالثي هو الغاية في خلايا هيلا الانقسامية، التي تشكل مادة RdRP المعقدة8،،من910. وهذا يشير إلى أن خلايا هيلا الانقسامية مادة أمثل للكشف عن النشاط RdRP. في البروتوكول، المذكورة أعلاه، الانقسامية وغير متزامنة هيلا يتم تضمين الخلايا إيجابية، ومن الأمثلة سلبية، على التوالي. كما هو موضح في الشكل 1A، منتجات الإنزيم RdRP من قالب الحمض النووي الريبي الموصى بها في خلايا هيلا الانقسامية إظهار إشارات مشعة واسعة بين 20 إلى 30 nt. بالإضافة إلى خلايا هيلا، لدينا إجراء المقايسة مع أنواع مختلفة من خطوط الخلايا، ووجدت أنه لا يمكن تغيير نمط الإشارات في خلية مختلفة الأنواع9: تظهر بعض إشارة قوية فقط حوالي 30 nt، تظهر بعض نمط مماثل مع خلايا هيلا. ونحن أيضا بإجراء المقايسة مع قوالب الرنا خلاف 34 قالب nt8، قصيرة وطويلة (~ 300 nt) الكشف مع تسلسل مختلف، ونجاح الحصول على منتجات RdRP من تلك القوالب رغم أنه قد تكون هناك بعض التفضيل. في المحاكمة الأولى، ومع ذلك، نوصي باستخدام خلايا هيلا في المرحلة الانقسامية والقالب nt الحمض النووي الريبي 34. ردربس يمكن أن تولد الرنا المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في تعتمد على التمهيدي وفي طريقة مستقلة عن التمهيدي11. وقد أبلغنا أن ثالثي يحتفظ بهذه الخاصية البشرية RdRP7،9؛ يجمع ثالثي دسرنا من قالب الجيش الملكي النيبالي مع هيكل 3 ‘-foldback من خلال إليه فتيلة ظهر7. 34 قالب nt الجيش الملكي النيبالي، يجمع ثالثي خيوط التكميلية دون استخدام كبسولة تفجير9. على وجه التحديد الكشف عن منتجات RdRP توليفها بطريقة مستقلة عن التمهيدي، أي دي نوفو توليف الحمض النووي الريبي المنتجات، [α-32ف] NTP يمكن الاستعاضة عن [γ-32ف] NTP في رد فعل RdRP9.
علاج منسى ثالثي مجمعات محصنة في الخرز خطوة حاسمة لتحقيق النتائج المرجوة. إذا كان يتم تنفيذ معاملة مناسى طويل جداً أو بالهز مكثفة، منتجات RdRP ستقل ملحوظ. لتجنب هذه المتاعب، نوصي بشدة على التقيد البروتوكول بعناية. الحل HMD عامل حاسم آخر للنجاح. إذا كنت تجد أن الإشارات ضعيفة جداً، يحل محل حل HMD واحدة أعدت حديثا.
في جميع أنحاء البروتوكول، واحدة ينبغي إيلاء عناية كبيرة لتفادي التلوث رناسي. ينبغي أن تجري معاملة ribonuclease مع معدات مخصصة. بعد التلاعب في Ribonuclease، واحدة ينبغي تجاهل نصائح وأنابيب مع رناسي فورا، القضاء على رناسي مع الحل المتخصصة (مثل هادئة رناسي)، وتغيير بساتين.
ثالثي يتفاعل مع ترك ليس فقط ولكن أيضا العديد من أنواع الكشف الذاتية، وكنا قد ذكرت جزءا منها7. التعديل في مقايسة RdRP الملكية الفكرية، مثل المقايسة RdRP الملكية الفكرية دون علاج مناسى، ستوفر قائمة كاملة من قوالب الرنا الذاتية لدليل النشاط و bioinformatic RdRP المرتبطة بمادة على ملامحها التسلسل. ونحن قد طبقت بنجاح هذا البروتوكول للأنسجة ليستي. لأن هو أعرب ثالثي في مجموعة متنوعة من الأنسجة العادية والورم، هذا التحليل قد تكون مفيدة للتحقيق غير متعارف عليه وظيفة ثالثي الأنزيمي في الإنسان.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل وأيده في الجزء المشروع “تطوير البحوث الابتكارية” في علاجات السرطان (فالمباشر) (15cm0106102h0002، ك. م.) والمشروع لأبحاث السرطان والتطور العلاجي (ف إنشاء) (16 سم 01061150001، ك. م.) من الوكالة اليابانية للبحوث الطبية والتنمية، AMED؛ مؤسسة العلوم وتاكيدا (Y.M.)؛ منحة صندوق أبحاث السرطان الأميرة تاكاماتسو (13-24520، Y.M.)؛ وعدد المنح JSPS كاكينهي JP16K07133 (Y.M.).
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Wako | 044-29765 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | CORNING | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin mixed solution | nacalai tesque | 26253-84 | |
| Trypsin-Ethylenediamenetetraacetic acid (EDTA) solution | nacalai tesque | 32777-44 | |
| Phosphate buffered saline (PBS(-)) | Wako | 166-23555 | |
| Thymidine | nacalai tesque | 07147-61 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | nacalai tesque | 08904-85 | |
| Sodium chloride | nacalai tesque | 31333-45 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | nacalai tesque | 35434-21 | |
| Hydrochloric acid | nacalai tesque | 18321-05 | |
| Nonidet P-40 (NP-40) | nacalai tesque | 25223-04 | |
| Pierce Protein A Plus Agarose | Thermo scientific | 22812 | |
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | nacalai tesque | 17514-15 | |
| Potassium hydroxide | Wako | 168-21815 | |
| Potassium acetate | nacalai tesque | 28405-05 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Wako | 135-00165 | |
| Glycerol | nacalai tesque | 17045-65 | |
| Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether (Triton X-100) | Wako | 169-21105 | |
| cOmplete, EDTA-free | Roche Applied Science | 11 873 580 001 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H2O) | nacalai tesque | 06731-05 | |
| Micrococcal nuclease (MNase) | Takara Bio | 2910A | |
| Ethylene glycol bis (b-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | nacalai tesque | 15214-92 | |
| 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS) | nacalai tesque | 07957-64 | |
| Dithiothreitol (DTT) | nacalai tesque | 14128-91 | |
| rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM each | Promega | E6000 | |
| [a-32P]UTP (3,000 Ci/mmol) | PerkinElmer | NEG507H | Use fresh RI for the assay |
| RNase inhibitor | TOYOBO | SIN-201 | |
| Proteinase K | Takara | 9033 | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Life Technologies | AM9720 | |
| 3 M Sodium acetate | NIPPON GENE | 316-90081 | |
| Ethanol (99.5) | nacalai tesque | 14713-95 | |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier | Takara Bio | 9094 | |
| RNase One Ribonuclease | Promega | M4265 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | nacalai tesque | 02873-75 | |
| Formamide, deionized | nacalai tesque | 16345-65 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (EDTA) | nacalai tesque | 15130-95 | |
| Orange G | nacalai tesque | 25401-22 | |
| CO2 incubator | e.g., ASTEC | SCA-325DRS | |
| Centrifuge | e.g., TOMY | EX-135 | For step B) |
| Micro refrigerated centrifuge | e.g., KUBOTA | 3740 | For step 6.2 |
| Sonicator | Qsonica | Q125 | Set a microtip (#4422) on the sonicator, for step 6.4 |
| Micro refrigerated centrifuge | e.g., TOMY | MX-305 | For step 6.5 |
| Cooled incubator | e.g., Panasonic | MIR-154-PJ | Set a rotary shaker inside |
| Rotary shaker | e.g., TAITEC | RT-5 | |
| Cooled incubator | e.g., TAITEC | BR-43FL | Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 7.7 |
| MINI WAVE | AS ONE | WEV-03 | A shaker for steps 7.7, 8.5 and 8.6 |
| Incubator | e.g., TAITEC | HB-80 | Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 8.5 and 8.6 |
| Block incubator | e.g., ASTEC | BI-516S |
References
- Martinez, P., Blasco, M. A. Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins. Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).
- Nakamura, T. M., et al. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science. 277 (5328), 955-959 (1997).
- Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).
- Salgado, P. S., et al. The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription. PLoS Biol. 4 (12), e434 (2006).
- Castel, S. E., Martienssen, R. A. RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond. Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).
- Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., Grewal, S. I. RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 152-157 (2005).
- Maida, Y., et al. An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA. Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).
- Maida, Y., et al. Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance. Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).
- Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase. Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).
- Okamoto, N., et al. Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).
- van Dijk, A. A., Makeyev, E. V., Bamford, D. H. Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization. J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).
