مقايسة إصلاح غشاء الخلية باستخدام مجهر ليزر اثنين-فوتون
Summary
جرح غشاء الخلية عن طريق الليزر اثنين-فوتون هو أسلوب مستخدمة على نطاق واسع لتقييم إمكانية إعادة ختم الغشاء ويمكن تطبيقها على أنواع متعددة من الخلايا. هنا، يمكننا وصف بروتوكول في المختبر العيش-التصوير لإعادة ختم غشاء في خلايا المريض ديسفيرلينوباثي بعد التذرية الليزر اثنين-فوتون.
Abstract
الشتائم الفيزيولوجية المرضية العديدة يمكن أن تسبب ضررا لأغشية الخلية، وعندما يقترن مع العيوب المتأصلة في تصليح غشاء الخلية أو النزاهة، يمكن أن يسفر عن المرض. فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء المحيطة بتصليح غشاء الخلية، ولذلك، هدفا مهما لوضع استراتيجيات علاجية رواية للأمراض المرتبطة بديناميات غشاء الخلية المفككة. تستخدم العديد من الدراسات في المختبر و في فيفو تهدف إلى فهم إعادة ختم غشاء الخلية في العديد من السياقات المرض التذرية الليزر اثنين-فوتون كمعيار لتحديد النتائج الوظيفية بعد علاجات تجريبية. في هذا التحليل، تتعرض أغشية الخلية للجرح بليزر اثنين-فوتون، الذي يتسبب في غشاء الخلية إلى تمزق وصبغة الفلورسنت لاختراق الخلية. يمكن رصد كثافة الأسفار داخل الخلية ثم لقياس قدرة الخلية على ختم نفسها. هناك عدة طرق بديلة لتقييم استجابة غشاء الخلية للإصابة، فضلا عن التباين الكبير في يومين-فوتون الليزر إصابة النهج نفسه، ولذلك، سيخدم نموذج وحيد وموحد لإصابة خلية مفيد إنقاص الاختلاف بين هذه المنهجيات. في هذه المقالة، نحن مخطط ليزر اثنين-فوتون بسيطة إصابة البروتوكول لتقييم غشاء الخلية إصلاح في المختبر في كلا صحية والمريض تنتجها الخلايا الليفية ديسفيرلينوباثي transfected الخلايا مع أو بدون بلازميد dysferlin كاملة طول.
Introduction
يتكون غشاء الخلية من الخلايا حقيقية النواة المزدوجة-طبقة من فوسفوليبيدات المرصعة البروتين الذي يحدد البيئة داخل/خارج الخلية للخلية وضروري للمحافظة على بقاء التوازن والخلية الخلوية. غشاء الخلية الإصابات الناشئة عن الشتائم الميكانيكية أو الكيميائية شائعة في مختلف أنواع خلايا الثدييات، بما في ذلك الهيكل العظمى وعضلة القلب والمعدة والرئة1،2،،من34خلايا. وبالإضافة إلى الإصابات نتيجة للوظيفة الفسيولوجية اليومية، يمكن أن تتلف أغشية الخلية بالشتائم البيئية والسموم البكتيرية وضخه الدماغية5. فشل إعادة ختم تمزق في غشاء الخلية يؤدي إلى تدفق غير منظم خارج الخلية Ca2 +-إلى جانب عناصر أخرى يمكن أن تكون سامة في خارج الخلية-داخل الخلية، تحريك الشلالات إشارة المتلقين للمعلومات التي يمكن أن تؤدي بسرعة في الخلية وفاة1،4،،من56.
وحتى الآن، وهناك العديد من النماذج المقترحة لإصلاح الغشاء في الخلايا. قد يتم تنشيط آليات إصلاح مختلفة تبعاً لحجم وطبيعة تمزق الأغشية. على سبيل المثال، يقترح أن أغشية الخلية قد تستخدم التدفق الأفقي أو انسداد لإصلاح الأعطال صغير البروتين (< 1 نانومتر). نموذج الانصهار الأفقي وتقترح أن تمزق الأغشية هي أوصت سريعاً من خلال توظيف الجانبية التي تحتوي على ديسفيرلين الغشاء7، بينما البروتين انسداد النموذج يوحي بأن الثقوب الصغيرة هي أوصت من خلال المجموعات البروتين (معظمهم من أننيكسينس) 8-على العكس من ذلك، يؤدي أكبر آفات الأغشية Ca2 +-حويصلة تعتمد، بوساطة dysferlin الانصهار وتكوين التصحيح إصلاح. في نموذج التصحيح إصلاح مشغلات Ca2 + تدفق سريع إلى الخلية تجنيد البروتينات متعددة (ديسفيرلين، أنيكسينس، ميتسوجومين-53، والبروتينات إده) التي تشكل مجمع أو “التصحيح”، جنبا إلى جنب مع مزيج من حويصلات داخل الخلايا أو ليسوسوميس في موقع الغشاء الأضرار4،،من910،،من1112. من المهم أن نلاحظ أن هذه النماذج لا يستبعد بالضرورة، وقد تعمل يدا واحدة لتسهيل إصلاح الغشاء. فشل إعادة ختم الضرر غشاء الخلية بشكل صحيح يرتبط مع دول المرض متعددة، بما في ذلك ضمور العضلات (ديسفيرلينوباثي-عضلي ميوشي وحزام أطرافهم ضمور العضلات النوع الثاني باء وعضلي القاصي مع بداية الظنبوبي الأمامي) 13،14من اعتلال عضلة القلب، و Higashi شيدياك متلازمة (CHS)15.
ونظرا لأن سلامة غشاء الخلية سليم وإعادة ختم يلعب دوراً مهما في الصحة والمرض، وفهم أعمق للآليات الجزيئية الكامنة لتصليح غشاء الخلية سيكون مفيداً في البحث عن استراتيجيات علاجية جديدة. ولذلك، من الضروري أن تمتلك التقنيات التجريبية المناسبة لرصد الحركية وتقييم قدرة تصليح غشاء الخلية. وقد صممت عدة أساليب في المختبر للنمذجة إصلاح الغشاء. تتضمن استراتيجية واحدة الإصابات الميكانيكية، التي يمكن أن يتيسر من خلال إلغاء الخلية مع بليد ماصة/جراحية/أسلاك شائكة أو عن طريق التدحرج الخرز الزجاج خلايا16. بيد أن هذا النوع من الإصابات الميكانيكية يولد أكبر الآفات، ويخلق درجة عالية من التباين في إصابة الخلية، سواء داخل أو بين الثقافات.
هو أسلوب آخر لتوليد الجروح غشاء التذرية الليزر قبل يومين-فوتون مجهرية. على عكس الليزر التقليدية مجهرية [كنفوكل] التي توظف الإثارة فوتون واحد، يستخدم الليزر اثنين-فوتون في وقت واحد اثنين الفوتونات طويلة-الطول الموجي، والطاقة المنخفضة تيسيرا للإثارة من الإلكترونات ذات الطاقة العالية17. نتائج هذه العملية غير الخطية في الإثارة حصرا ضمن المستوى البؤري ولا على طول المسار بأكمله الخفيفة17 (الشكل 1). وهذا تخفيض الإثارة حجم يساعد على تقليل د عند التصوير الخلايا الحية18،19. ولذلك الباحثين قادرين على توليد آفات دقيقة في غشاء الخلية ورصد غشاء إعادة ختم في الوقت الحقيقي باستخدام الأصباغ الفلورية، ومراقبة التغيرات في كثافة الأسفار تمزقات غشاء الخلية ومن ثم ريسيلس.
وقد استخدمت مرارا وتكرارا لدراسة الغشاء مما أدى إلى إصابة في المختبر و في فيفو هذا النهج وفي خلايا متعددة الأنواع20،21. على سبيل المثال، غشاء إصلاح العيوب الموجودة في الخلايا الليفية و myotubes المستمدة من ديسفيرلينوباثي تم تقييم المرضى باستخدام هذا الأسلوب،من2223. أيضا، استخدمت ألياف العضلات واحدة معزولة من الفئران لرصد إصلاح تصحيح تشكيل13،،من2425. ويمكن أيضا ملاحظة الحركة البروتينات فلوريسسينتلي المعلمة أثناء تصليح غشاء في ألياف العضلات واحد9. وعلاوة على ذلك، يمكن ملاحظة عملية إصلاح ساركوليمال عقب إصابة اثنين-فوتون الليزر في الأجنة الزرد في الوقت الحقيقي في فيفو26.
في هذه المقالة، نحن مخطط منهجية لتقييم ديناميات تصليح غشاء الخلية في الخلايا الليفية باستخدام الليزر اثنين-فوتون إصابة، على الرغم من أن هذه المنهجية يمكن تطبيقها على مختلف أنواع الخلايا غرض التحديد الكمي لغشاء البلازما إعادة ختم القدرة في المختبر. في هذا الأسلوب، يتم المحتضنة الخلايا مع FM4-64، صبغة محبتين، خلية كتيمة فلوريسسيس بسرعة كما أنه يربط سلبا تهمة فوسفوليبيدات داخل السيتوبلازم عند دخول الخلية عن طريق الآفة الأغشية (الشكل 2& 3)-التحديد الكمي لصبغ fluorescence المتاخمة للآفة غشاء يسمح بمراقبة الوقت الذي يستغرقه لغشاء الخلية لإعادة ختم نفسها. لتجسد مدى فائدة هذا الأسلوب، نستخدم ديسفيرلينوباثي الليفية المريض transfected مع البلازميدات dysferlin كامل طول مترافق التجارة والنقل (ديسف) لتقييم عملية الإنقاذ لإصلاح غشاء الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
مما أسفر عن إصابة اثنين-فوتون الليزر من غشاء الخلية تقنية دقيقة وتنوعاً لتقييم ديناميات غشاء إعادة ختم في المختبر. في هذه المقالة، نحن وصف بروتوكول لتحديد الخلية غشاء إعادة ختم القدرة في خلايا المريض ديسفيرلينوباثي باستخدام الليزر اثنين-فوتون إصابة المقايسة. النتائج التي توصلنا إلي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان تدعمها جامعة ألبرتا كلية الطب وطب الأسنان و “أصدقاء من غاريت كومينغ رئيس صندوق أبحاث”، رئيس صندوق أبحاث العلوم العصبية توبين جلالة، “ضمور العضلات كندا” و “المؤسسة الكندية” للابتكار (CFI)، ألبرتا متقدمة والتعليم والتكنولوجيا (بعد التمديد)، والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (استوفوا)، رحلة جيسي–الأساس للجينات والعلاج بالخلايا، والنساء والأطفال في معهد بحوث الصحة (وتشري)، والبرتا يبتكر الحلول الصحية (عيس ).
ونود أن نشكر الدكتور ستيفن لافال لإمداد لنا مع بلازميد dysferlin كاملة الطول. ونود أيضا أن نشكر الدكتور كاتسويا مياكي للمشورة التقنية.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 35mm collagen-coated glass-bottom dishes | MatTek | P53GCOL-1.5-14-C | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| FM 4-64 Dye | Invitrogen | T13320 | |
| Tyrode’s Salts Solution | Sigma-Aldrich | T2397 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | NA | |
| Chameleon Two-photon laser | Coherent | NA |
References
- Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).
- Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).
- McNeil, P. L., Ito, S. Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo. Gastroenterology. 96 (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).
- McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 499-505 (2005).
- Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiol Rev. 95 (4), 1205-1240 (2015).
- Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells. Am J Physiol. 261 (5 Pt 1), C889-C896 (1991).
- McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair. FASEB J. 28 (8), 3660-3670 (2014).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4 (Unit 4), 11-24 (2013).
- Demonbreun, A. R., et al. An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle. J Cell Biol. 213 (6), 705-718 (2016).
- McNeil, P. L., Khakee, R. Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage. Am J Pathol. 140 (5), 1097-1109 (1992).
- Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J Cell Biol. 137 (1), 93-104 (1997).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423 (6936), 168-172 (2003).
- Han, R., et al. Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury. J Clin Invest. 117 (7), 1805-1813 (2007).
- Huynh, C., Roth, D., Ward, D. M., Kaplan, J., Andrews, N. W. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (48), 16795-16800 (2004).
- Corrotte, M., Castro-Gomes, T., Koushik, A. B., Andrews, N. W. Approaches for plasma membrane wounding and assessment of lysosome-mediated repair responses. Methods Cell Biol. 126, 139-158 (2015).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Jontes, J. D., Buchanan, J., Smith, J. S. Growth cone and dendrite dynamics in zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo. Nat Neurosci. 3 (3), 231-237 (2000).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4592-4597 (2003).
- Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. J Vis Exp. (52), (2011).
- Matsuda, C., Kiyosue, K., Nishino, I., Goto, Y., Hayashi, Y. K. Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair. PLoS Curr. 7, (2015).
- Philippi, S., et al. Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy. PLoS Curr. 4, RRN1298 (2012).
- Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11 (1), 56-64 (2009).
- Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (16), 6004-6009 (2014).
- Roostalu, U., Strahle, U. In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma. Dev Cell. 22 (3), 515-529 (2012).
- Azakir, B. A., et al. Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules. J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).
- Lee, J., Yokota, T., Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. Ch 6. Translational Research in Muscular Dystrophy. , 87-102 (2016).
- Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies. Mol Med. 17 (9-10), 875-882 (2011).
