טיהור של Hepatocytes ותאי אנדותל Sinusoidal מן הכבד העכבר זלוף

כל ההליכים בבעלי חיים המתוארות ב פרוטוקול זה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) ב אוניברסיטת לינקולן – נברסקה תחת פרוטוקול #1435. 1. הכנה אופן ההכנה של פתרונות ומדיה תרבות להכין את כל מאגר לפי הטבלה של חומריםומדיה תרבות. הכנת כלי נגינה להגדיר באמבט מים (> 10 L)-42 ° C, משאבה סחרור עם מהירות משתנה, אבזמי מחזיק מבחנות. להכין מספריים מעוגלים מלקחיים (איור 1). או בסמוך לאמבט מים, להגדיר את גיליון האפייה (בערך 38 x 26 ס”מ) עם כרית קלקר (50 מ ל חרוט ארון תקשורת), ועליהן. underpad ספיגה לחתוך חתיכה 20 x 20 ס מ (איור 1). מניחים חתיכת המסיכה קלטת (5-8 ס מ) בקרבת מקום. במקום חוט תפירה פוליאסטר 20 ס מ בקרבת מקום זה גזור ומוכן לשימוש. להשיג צנתר פלסטיק עם מחט לשליפה (7 מ מ x 19 מ מ, איור 1). הכנת כלי זכוכית באמצעות מלחציים, מקום, לשתק בקבוקון 1 ליטר באמבט מים המכיל 200 מ של PBS x 1 עם פקק בעל שני פיפטות של 1 מ”ל נכנס הפתרון. פקק גומי מחורץ כדי לאפשר recirculation של נוזל במעגל סגור. עם מלקחיים, במקום בקבוקון 125 מ ל המכיל 45 מ של מאגר 2 יחד עם פקק בעל 2 פיפטות של 1 מ”ל, שאחת מהן היא בתוך הנוזל ליד החלק התחתון של הבקבוק והשני אשר נשאר מעל הנוזל ומפוצץ חמצן לתוך הבקבוק.הערה: כל פיפטה, פקקים יהיה מהיר נתק את מתאם המצורפת לקצה עבור החלפה של הצנרת. חמצן זורמים בעדינות לתוך שתי מבחנות דרך פיפטה של פקק זה לא שקועה בתוך הנוזל. להפריש שתי מנות התגבשות סטרילי. 2. שגרת חיים לחמם את הפתרונות PBS ו- 2 מאגר 42 ° C באמבט מים, הפיצו PBS לפחות 20 mL/min בהצנרת במעגל סגור כדי לחמם את הקווים נוזלי. לטבול כל צינורות עודף באמבט מים להישאר קרוב ככל האפשר ל 42 º C. מרוקנים את הסוף זכר של הצנרת לתוך PBS המכיל הבקבוקון 1 ליטר. במקום כדור צמר גפן על underpad סופג ולהוסיף בערך 2 מ ל 30% איזופלוריין (המורכב ב פוליאתילן גליקול 200 אשר מפחית את קצב אידוי של איזופלוריין) על הכדור כותנה באמצעות פיפטה של העברה. הרם את העכבר בזנבו, למקם אותו באחד הכלים crystallizing, ואז להפוך את המנה על כדור צמר גפן במהירות כך העכבר יש רווח קטן שבו לשאוף ההרדמה. לבחון את קצב הנשימה של העכבר ולהבטיח שהעכבר הוא יעיל תחת הרדמה.הערה: קצב הנשימה צריכה להיות איטית ועמוקה, הזנב רפוי, את כפות רגליו מצבו במבחן קמצוץ בהרדמה; ראה הנחיות IACUC לפרטים נוספים. בזמן העכבר נמצא תחת הרדמה (זה לוקח 1-2 דקות), הכן הקנה של מזרק 10 מ”ל על ידי הוצאת הבוכנה והכנסת כדור צמר גפן קטנים. להוסיף 1-2 מ ל 30% איזופלוריין עם פיפטה העברת הכדור כותנה בתוך החבית ולמקם החבית open-end למטה על השולחן בעת המתנה העכבר כדי להפוך ללא הכרה. מהר להוריד את המנה crystallizing, הפוך את העכבר על גבו ולמקם החבית המזרק מעל האף שלה. שח כפול קצב הנשימה, קמצוץ הבוהן, וזנב רפוי. תגובות על הבוהן קמצוץ וזנב רפוי מציין כי העכבר אינו מלא תחת הרדמה. לשמור את הקנה המזרק מעל החוטם כדי לשמור על חוסר הכרה. המקום האגודל tacks דרך כפות רגליו של העכבר, עם הגפיים מתוחות במצב פרקדן. הרטב את הבטן ואת הצלעות עם אלכוהול איזופרופיל 70% או אתנול. עם המלקחיים ישר ביד אחת, מרים את העור ליד הבסיס של הבטן. עם מספריים ביד אחרים, לחתוך את העור והפופולרית, הצפק. החתך צריך להיות אופקי או על פני הבסיס של העור והפופולרית. יש להקפיד לחתוך דרך כל השכבות של העור, צפק כדי לקבל גישה אל הבטן. חותכים רוחבית סביב הבטן עד הצלעות משני הצדדים ללא חותך את כל האיברים. לחתוך את פיסת עור על ידי חיתוך לרוחב הצלעות התחתון. להזיז את המעיים מימין עם האחורי של המלקחיים לחשוף את וריד שער הכבד.הערה: דימום מהחיה צריך להיות מינימלי; צריך החיה עדיין לנשום תחת הרדמה עמוקה. המקום סגור המלקחיים מעוקל מתחת וריד שער הכבד בין הכבד pancreaticoduodenal מעולה וריד (איור 3 חץ). פתח את המלקחיים בזמן מתחת וריד שער הכבד. החוט ומשוך בזהירות כך ממורכזת מתחת וריד שער הכבד. לקשור קשר בוהן סביב וריד שער הכבד בלי cinching זה למטה. מקום המלקחיים מעוקל תחת וריד שער הכבד, משוך אותו בעדינות לכיוון הזנב של העכבר כדי לסדר את הווריד (איור 4א). עם הצנתר וביד השנייה, הניחו השיקוע של המחט, פנים כלפי מעלה ואת מקבילים עם החלק התחתון של וריד שער הכבד ליד המלקחיים (איור 4B). לנקב את הווריד בעדינות עם המחט (איור 4C). ודא שהשיקוע של המחט נמצא לומן של הווריד. . משכי את המחט הקופצני, להמשיך לדחוף את הצנתר פולימר דרך הווריד של עד השיקוע ליד אזור מסועף ורידים. . זה בתוך הכבד. אם הצנתר ממוקם כראוי, הגב-נזילת דם יהיה גלוי. (איור 4D). להדק את קשר בוהן, למשוך את זה מה שיעזור לייצב אותו. מיד להנמיך את שער משאבת בין 20 mL/min 4 mL/min וחותכים עוד כלי דם גדולים ניקוז. חותכים את abdominalis העורקים לקבלת תוצאות אופטימליות. מקום לסוף זכר הצנרת עד הסוף הנשי של הקטטר (איור 5א). ודא כי ישנם אין בועות אוויר בתוך הקו. להיזהר כי הצנתר אינה גם דחפה את הכבד או את הווריד. השמה של החוט אינה חיונית, אם כי היא מסייעת למנוע זרימה חזרה החוצה הווריד ומסייעת לשמור את הצנתר בתנוחה הנכונה (איור 5ב, ג). השתמש המסיכה קלטת כדי לשתק את הצנרת על גבי underpad. השתמש המלקחיים ישר כדי לסחוט את כלי הדם קולחים לנפח את הכבד כמה פעמים כדי להבטיח כל הדם יש אזל (איור 5D).הערה: הקלטת מעבדה סטנדרטיים לא יפעלו; עם זאת, המסיכה קלטת יישארו דבוקות underpad, אפילו בתנאים רטובים. 3. הכבד זלוף ואילו הכבד הוא שטיפה עם PBS, למדוד החוצה על 24 מ ג IV סוג Collagenase, ממקמת הבקבוקון המכיל 45 מ של מאגר 2 באמבט מים. הקפד מערבולת הנוזל בתוך הבקבוק כך collagenase באופן מלא התפרקה ולמקם את הבקבוק בחזרה המלחציים כך החלק המכיל נוזלי + בקבוקי שתייה צידניות באופן מלא שקוע במים. להבחין בשינוי הצבע של הכבד כפי שזה התרוקן עם PBS. לשנות את הצנרור יצוא מן הבקבוק 1 ליטר הבקבוקון 125 מ. אל תאפשר בועות אוויר לזרום לתוך הכבד. ברגע המאגר זלוף מגיע הכבד, בקצרה מחצי חזק את כלי הדם קולחים לבנות קצת בלחץ בתוך הכלי ולאפשר הנוזל למלא כל אונות הכבד. הקפד לא לחתוך את ניקוז ארוך מדי, כמו זה ייתכן פרץ רקמת חיבור דק סביב הכבד (הקפסולה של גליסון) ולהשמיד את זלוף או זרימה של נוזל בתוך המיטה נים של הכבד. לאפשר מאגר 2 עם collagenase כדי perfuse דרך הכבד עד 45 מ ל כל זרמו דרך הרקמות.הערה: אם מצליחים, הכמוסה של גליסון להפרידם parenchyma או רקמת הכבד, הכבד עצמו אמור להופיע אמורפי. להוסיף כ- 10 מ”ל של מאגר 1 למנה crystallizing אחרים והצב אותה ליד העכבר. להסיר את הצנתר ולכבות את המשאבה. עם מלקחיים ישר, מספריים, חותכים את הכבד מן העכבר. אם העיכול collagenase היה מאוד יעיל, ייתכן צורך את הכף נקי, סטרילי על היד כדי להיפטר הכבד מן העכבר ולמקם אותו מאגר 1. 4. hepatocyte טיהור הערה: מניפולציה של התאים מבוצעות בשכונה תרביות רקמה סטרילי כדי להגביל זיהום אם התאים להיות בתרבית בצעדים העוקבים כל. שימוש סטרילי טכניקה, לתפוס את הכבד עם מלקחיים ומנערים בעדינות תאים מן הכבד. להפריד או התרחק הכמוסה של גליסון: המאגר יהפוך אטום כמו תאים הם מזועזע מן הכבד. שופכים את הפתרון תא לתוך חרוט 50 מ עם מסנן 100 מיקרומטר, מניחים מעל. להוסיף עוד 1 מאגר שרידי כבד ולהמשיך תיכנסנה תאים. המשך עד הכבד מופיע ללא תאים או כאשר החלקים מעוכל הכבד לא תשואה יותר תאים. שופכים את הנוזל הסלולר לתוך עוד 50 מל חרוט המכיל מסנן מיקרומטר 40. Centrifuge חרוט בתוך הרוטור דלי מתנדנדים ב 100 x g למשך 3 דקות.הערה: אין להשתמש בבלמים המרבי כמו זה עשוי לסלק בגדר תא. להשתמש את הבלם ב 80% וזה מספיק עבור כל השלבים הנותרים צנטריפוגה ב 4 ° C יוצקים את תגובת שיקוע (אשר מכיל NPCs, מת hepatocytes) לתוך חרוט נקייה ומניחים אותו על קרח. ודא שזאת בתנועה אחת להתבונן צניפה הדבקות. Resuspend בגדר ב- 40 מ”ל של מאגר 1. חזור על שלבים 4.5 ו- 4.6. Resuspend בגדר ב- 40 מ”ל של מאגר 3. חזור על שלבים 4.5 ו- 4.6 פעמיים. Resuspend את hepatocytes מטוהרים חמים DMEM + 10% FBS + 2 x פניצילין-סטרפטומיצין (עט/דלקת). אם התאים מתורבתים על קולגן מצופה לוחות, לאפשר להם לפעול ולהתבטא עבור 1 h, החלף המדיה לפחות פעם אחת כמו זה ימנע כל המתהווה חיידקים מזהמים. להפוך את הצלחות קולגן מצופה על-ידי המקננת בהם עם 0.05% קולגן ב- 0.001% חומצה אצטית במשך לפחות שעה ב 37 ° C ולאחר מכן כביסה עם 1 x PBS. אם הכדאיות hepatocyte הוא נמוך, ויש רצון להשיג hepatocytes גבוהה-קיימא מטוהרים ואז להשתמש בפרוטוקול הבא הותאם ואחKreamer10. מיקס 9 כרכים של פתרון של PVP (Percoll, פתרון w/w 23% מים ו- 15-30 ננומטר סיליקה colloidal חלקיקי מצופה פוליוינילפירולידון עבור צפיפות צנטריפוגה) ונפח 1 של x HBSS 10 כדי להפוך פתרון PVP iso-osmotic (SIP). להוסיף מ 24 ל- SIP סטרילי 50 מ ל חרוט עשוי להיות מאוחסן בתנאים אלו עד 2 חודשים-4 מעלות צלזיוס. התאם את הריכוז hepatocyte ל 5-10 × 106 תאים למ”ל תרבות בינונית כמו שרשמת בשלב 4.8. להוסיף 25 מ של השעיה תא כל מ ל 24 SIP המכיל חרוט ומערבבים על ידי היפוך עדין. הצפיפות של פתרון זה הוא 1.06 g/mL. Centrifuge חרוט ב g x 50 דקות 10-4 מעלות צלזיוס. האחות SIP ו גדול, resuspend תאי HBSS. לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה-50 גרם x 10 דקות ב 4 º C. חזור על שלב 4.10.6 עוד פעם אחת, ואז resuspend בתאים מדיום הגידול. 5. טיהור סק גלולה התאים supernatants מהשלב 4.6 על ידי סחרור הצינורות ב 163 x g עבור 10 דקות להשליך את supernatants מן הצינורות resuspend כל תא כדורי ב 5 מ של RPMI ללא סרום, בריכה אותם יחד בצינור אחד. ברגע שיש כבר איחדו את כל החבילות, להוסיף RPMI לנפח סופי של 35 מ. Centrifuge את במאגר חרוט ב 25 x g עבור מינימלית 3 בקפידה תשאף mL 25 העליון של RPMI עם 25 מ ל פיפטה, המקום הזה המדיה המכילה NPCs ב נקי 50 מ ל חרוט על קרח. להוסיף 25 מ של טרי RPMI בחזרה הצינור, resuspend בגדר. חזור על צעד 5.3 חדר שטיפת השני ובריכת תגובת שיקוע. למחוק את 10 מ”ל הנותרים של מדיה גלולה (בגדר מורכב בעיקר מת hepatocytes). Centrifuge את תגובת שיקוע במאגר-163 g x 10 דקות. במהלך צנטריפוגה, להכין את מעברי צבע פתרון PVP ב חרוט 50 מ. להוסיף 15 מ”ל של 50% פתרון PVP 50 מ ל חרוט ואחריו 20 מ של 25% Percoll ועליהן pipettor להגדיר למהירות האיטית ביותר הפליטה. הקפד לצפות קו שבירה-סימון 15 מ”ל demarcates שתי שכבות, כמו זה שבו שניות של kcs ב לצבור לאחר צנטריפוגה. Resuspend התאים מגורען בעבר בשלב 5.5 ב 10 מ של RPMI קר, כיסוי אותם אל מעבר הצבע פתרון של PVP. הקפד לשמור על תיחום ברור בין שתי השכבות. Centrifuge מעבר הצבע ב 805 g x עבור 20 דקות עם בלם שוכן בגובה 50%. האחות מלמעלה למטה לכיוון לסימן 20 מ”ל ברכבת התחתית ולמחוק את החומר הזה. עם פיפטה העברה 5 מ”ל, לאסוף את שניות kcs ב הממוקמים במקום הממשק 25/50%. להתעלם כל גושים חומים של תאים כמו אלו hepatocytes מת. למקם את תאי חרוט 50 מ ל, להוסיף RPMI עד כדי לסמן 50 מ ל כדי לדלל את הפתרון PVP. צנטריפוגה-200 גרם x 10 דקות, עם 80% בלם. האחות למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר בעת שטיפת את ספירלת חרוט ב 12 מ של RPMI חמים. להפריד את שניות kcs על-ידי הצבת את תגובת שיקוע פוליסטירן פטרי, דגירה ב חממה תרביות רקמה humidified במשך 8 דקות בטמפרטורת החדר. האחות התקשורת עם פיפטה 25 מ ל, יש לשטוף הצלחת עם המדיה, עם pipettor הגדר במהירות הנמוכה ביותר כדי לאסוף את שניות שנותרו בזמן kcs ב לדבוק הצלחת. Centrifuge את שניות ב 200 x g למשך 10 דקות, resuspend RPMI + 5% FBS + עט/סטרפ. ואז כייל התאים, והמקום במנות תרבות מצופים קולגן.