Medición en tiempo real de la permeabilidad de la barrera epitelial en organoides Intestinal humano

Normal, anónima tejido intestinal adulto humano se obtuvo de donantes de órganos fallecidos por el regalo de la vida, Michigan. ES humanos de células H9 (registro NIH #0062) se obtuvo del Instituto de investigación WiCell. Todos los tejidos humanos utilizados en este trabajo se obtuvieron de donantes vivos no, se identificó y se llevó a cabo con la aprobación de la IRB de la Universidad de Michigan (protocolo # HUM00093465 y HUM00105750). 1. microinyector configuración Obtener los materiales listados en la Tabla de materiales. Colocar el instrumental quirúrgico, disección alcance y fuente de luz en la seguridad de la biotecnología gabinete. Limpiar la configuración de la microinyección con etanol al 70% u otro desinfectante antes de su uso experimental. Evitar la exposición prolongada a los desinfectantes que contienen cloro, que puede corroer el equipo de microinyección.Nota: En la figura 1se muestra un ejemplo de un conjunto completo microinyector. Coloque el disección alcance de modo que el ocular puede ser utilizado a través del puerto de acceso en el escudo para el gabinete de seguridad de la biotecnología. Alternativamente, use un banco limpio con sistema de flujo de aire positivo en lugar de una bioseguridad con puntos de acceso de microscopio. Montar el instrumental quirúrgico a la derecha del microscopio según las instrucciones del fabricante y ajustar de manera que los controles pueden ser alcanzados fácilmente y ajustados. El instrumental quirúrgico debe montado sobre una placa de hierro u otro modo estabilizado.Nota: Los usuarios zurdos puede colocar el instrumental quirúrgico a la izquierda de la disección alcance. Montar el soporte de la micropipeta al brazo de amalgamas dentales y conecte el tubo análogo insertando en el soporte de Micropipetas. Llene la jeringa de vidrio de 10 mL con aproximadamente 5-7 mL de aceite mineral estéril. Conecte la jeringa de vidrio 10 mL llenada de aceite mineral en el extremo abierto del tubo analógico utilizando el mecanismo de la cerradura de Luer. Colocar la jeringa de vidrio a la izquierda de la disección alcance, enfrente de las amalgamas dentales. Presione suavemente la jeringa, empujando el aceite mineral a través de la tubería. Descarga aproximadamente 10 gotas de aceite mineral de la punta de la titular de la micropipeta y recoge en una placa de Petri o recipiente similar y deseche.Nota: Este paso elimina todo el aire de la tubería y debe realizarse antes de cada sesión de microinyección. 2. preparación para la microinyección 24 h antes de la microinyección: Preparar solución de dextrano FITC suspendiendo a dextrano FITC a una concentración de 2 mg/mL en PBS estéril o en solución salina. Preparar un volumen total de > 250 μl.Nota: Mayor o menor concentración de FITC-los dextranos se puede utilizar, que van desde aproximadamente 0.1 – 10 mg/mL. Ajustar la concentración de FITC-los dextranos para abajo la aplicación proyección de imagen. Disposición organoide culturas en 4 o 8 pozos vidrio cámara diapositivas u otro buque de cultura adecuado para vivircon la microscopia, con hasta 4-6 HIOs por pozo, embebido en la solución a 50 μl célula matriz y cultivadas en EGF, Noggin y R-Spondin (ENR) factor de crecimiento medios 19 ,24. Tenga cuidado de espaciar las organitas uniformemente (aproximadamente 5 mm de separación) para evitar la captura de HIOs múltiples en un solo campo microscópico durante el análisis de imágenes en tiempo real. Para una guía completa a la cultura HIO y mantenimiento ver McCraken et al. 24.Nota: Este protocolo fue desarrollado usando derivados de células madre HIOs y resultados representativos (véase abajo) demuestran el uso de este modelo de cultivo de tejidos. Sin embargo, el mismo protocolo se adapta fácilmente a organoides epiteliales intestinales derivados de tejido15,29. Derivados de tejido HIOs son típicamente más pequeños que HIOs derivados del PSC y falta el apoyo mesenquimales basolateral de la célula estructura15,29,30. Microinyección de HIOs derivados de tejido puede requieren un mayor grado de capacidad técnica y experiencia. El grado a que datos de permeabilidad de la barrera epitelial obtenidos mediante HIOs derivados de tejido pueden correlacionar con HIOs hPSC-derivado es desconocido. Incube los HIOs en una incubadora de cultura de célula estándar de 42 ° C y 5% de CO2 antes de la microinyección. 30 minutos antes de la microinyección, girar sobre la bioseguridad en gabinete y levantar el escudo de cristal a la altura de trabajo óptima. Retire todos los elementos innecesarios de la gabinete de bioseguridad. El desorden aumenta el riesgo de derrames u otros accidentes cuando trabajan en espacios confinados. Rocíe y limpie la superficie de trabajo con etanol al 70% u otro desinfectante. Limpie con una toalla de papel. Compruebe el nivel de aceite mineral en la jeringa de vidrio conectada a la microinyectora. Si hay menos de 3 mL de aceite mineral restante, desenrosque la jeringa y rellenar en el gabinete, teniendo cuidado de no introducir burbujas de bioseguridad. No llene más de 7 mL. Encender la lámpara para iluminar el ámbito disección. Ajuste del ocular para comodidad personal. Coloque el instrumental quirúrgico a la derecha de la disección alcance. Garantizar el instrumental quirúrgico a una placa de hierro con un soporte magnético. El soporte magnético del interruptor a la posición OFF para ajustar la posición de las amalgamas dentales y fije el soporte a la placa del hierro estableciendo el soporte magnético en la posición ON. Instalación de Microcapillary Recuperar un filamento de vidrio de 1 mm solo en el recipiente proporcionado por el fabricante. Inserte el filamento de vidrio a través del centro de la bobina de cobre de la calefacción del tirador de una micropipeta.Nota: Véase la figura 2 una guía para preparar el tirador de la micropipeta. Coloque el filamento para que la bobina de calefacción de cobre es aproximadamente en el centro del filamento de vidrio. Esto asegurará que el extractor genera dos agujas de microinyección usable de cada filamento de vidrio. Asegure el filamento de vidrio utilizando las pinzas apretando la parte superior la abrazadera, asegurándose de que el filamento de vidrio se fija dentro de la arboleda con muescas para evitar la rotura. Extienda el brazo del tirador en su posición vertical máxima antes de apretar la abrazadera inferior.Nota: Este paso es esencial. Extienda completamente el brazo tirador contrario en separación irregular de las dos secciones del filamento de vidrio. Compruebe la configuración de la calefacción y el mecanismo de tracción.Seleccione calor #1 con la palanca (990) y ajuste tire 059 (figura 2). Encienda el instrumento con el botón de encendido/apagado. Cierre el escudo protector de plexiglás y presione el botón de tirar en la cara de derecha inferior del extractor. La bobina de cobre empezará a calentarse e iluminará de color naranja brillante. Se eleva la temperatura, el filamento de vidrio comenzará a estirar y separar eventualmente. Sobre la separación de los dos extremos del filamento de cristal, el instrumento se apagará.Nota: La bobina de cobre seguirá siendo extremadamente caliente durante varios minutos. El filamento de vidrio tirado se hará referencia a como un ‘microcapillary’ desde este punto hacia adelante en el protocolo. Teniendo cuidado de evitar tocar el cobre de la bobina, eliminar uno de los microcapilares de vidrio. El microcapillary tengan una punta muy fina. Manejar la microcapillary cuidadosamente con guantes de látex o nitrilo y proceder inmediatamente al gabinete de seguridad que contiene la configuración microinyector.Nota: El microcapillary de vidrio es muy fuerte y muy frágil. Manéjela con cuidado. Afloje el tapón del extremo del brazo de instrumental quirúrgico. Inserte el extremo despuntado de la microcapillary tirado en el extremo abierto del titular de la micropipeta y empuje hacia adentro hasta que se detiene. Asegure el extremo despuntado de la microcapillary en el brazo de instrumental quirúrgico por volver a apretar el tapón.Nota: Al instalar el microcapillary en el sistema de microinyección tenga cuidado para evitar tocar el extremo afilado. Esto reducirá la posibilidad de contaminación y preservar el punto fino para microinyección. No correctamente la microcapillary puede resultar en inestabilidad y rotura de los filamentos de vidrio durante la microinyección. Abra la punta de la microcapillary de vidrio. Durante la preparación de la microcapillary de vidrio tirado, la punta del punto probablemente se derretirá en tal forma que selle el extremo puntiagudo de la microcapillary. Para quitar este bloqueo: Coloque el instrumental quirúrgico que el microcapillary apunte hacia abajo en la fase de cristal del alcance disección sin tocar esta superficie. Encontrar una superficie estéril de plástico (el reverso de una tapa de placa de cultura funciona perfectamente) y colóquela sobre la platina del microscopio directamente debajo de la aguja del microcapillary en la etapa de la disección alcance. Centro de la punta de la microcapillary en el área de visualización y asegúrese de que está visible cuando se mira por el ocular del microscopio bajo 1.5 aumentos. Utilizando los controles de instrumental quirúrgico, avanzar lentamente el brazo de amalgamas dentales y microcapillary hacia la tapa de plástico estéril de la cultura hasta que la punta apenas entra en contacto con la superficie de plástico y la punta de la microcapillary rompe gratis.Nota: Busca la menor rotura posible que permite el flujo de fluidos desde el vidrio para reducir al mínimo el daño a la HIO durante microinyección. De nuevo el microcapillary lejos de la estéril superficie para minimizar la posibilidad de rotura accidental antes de proceder. Compruebe microcapillary para flujo presionando la jeringa de vidrio, empujando el aceite mineral a través de la tubería. Si se ha abierto al final de la microcapillary, verá una pequeña gota de aceite mineral emerge desde la punta de la microcapillary después de unos segundos. Si esto no ocurre, repita el paso anterior y vuelva a probar. 3. estéril microinyección Nota: Una vez que el microcapillary ha sido preparado, instalado y probado, comienzan microinjecting HIOs. La figura 3 ilustra un HIO derivados de tejido que se ha inyectado con éxito con FITC-los dextranos. Llenar el microcapillary con el material de inyección. Sumerja la punta de la microcapillary de cristal en la suspensión de inyección de dextrano FITC, teniendo cuidado de no romper la punta de la microcapillary contra los lados o el fondo del tubo. Una vez que la punta de la microcapillary se sumerge en la solución, tire hacia atrás de la jeringa de aceite mineral a aproximadamente 10 μl de la suspensión de dextrano FITC en el microcapillary.Nota: Se recomienda utilizar tubos de 1,5 mL o 0,5 mL para las soluciones de inyección/culturas puesto que estos serán más fácilmente accesible a lo microcapillary instalado. Por otra parte, inyección de soluciones se pueden extraer de una caja de Petri estéril o parafilm estéril, que puede reducir la posibilidad de lesiones de objetos punzocortantes, limitando la necesidad de sujetar un tubo en proximidad cercana a la microcapillary. Si la suspensión es altamente viscosa o si la apertura de la microcapillary es excepcionalmente pequeña, tarda varios segundo para llenar el microcapillary. No sacar suspensiones de microinyección en el tubo de plástico microinyección: esto puede contaminar el sistema de microinyección todo. Deje de llenar la microcapillary cuando la suspensión de microinyección llena el 90% de la longitud de la microcapillary de vidrio. Presione ligeramente la jeringa antes de retirar el microcapillary de la solución de microinyección para asegurar que la punta de la microcapillary no contiene bolsas de aire.Nota: Si el examen de la microcapillary revela bolsillos de aire, vacíe y vuelva a llenar. Saque la placa de cultura HIO la incubadora de cultivo celular y la transferencia para el gabinete de seguridad de la biotecnología con la microinyectora. Retire la tapa de la placa de cultivo HIO en el gabinete de seguridad de la biotecnología y centro el primer pozo en la platina del microscopio para que sea visible a través del ocular del telescopio en la posición más baja de la ampliación. Gire el brazo de instrumental quirúrgico que apunte hacia abajo la microcapillary en la cultura HIO en un ángulo > 45° con respecto a la platina del microscopio. Esto se logra más fácilmente girando manualmente el conjunto instrumental quirúrgico del brazo sobre su eje horizontal en el punto donde el apoyo de brazo horizontal instrumental quirúrgico con el soporte vertical, puesto que los controles finos (diales negro) tienen un rango limitado de movimiento. Coloque la punta de la microcapillary sobre la primera cultura en aproximadamente 1 cm sobre la superficie de los medios de comunicación (Figura 3A). Una imagen representativa demostrando microinyección de organoides epiteliales intestinales derivados de tejido se muestra en la figura 3B. Compruebe que tanto la punta de los filamentos de vidrio y el HIO(s) son visibles a través del ocular. Vuelva a colocar si es necesario. Avanzar lentamente el microcapillary girando la perilla de control del eje z.Nota: Según la posición de la punta de microcapillary, particularmente la profundidad, requiere práctica. Como el Consejo viola la superficie de los medios de comunicación, notar una leve distorsión visual de la punta de microcapillary.Proceda con cuidado desde este punto para evitar romper la microcapillary contra la parte inferior de la placa de cultivo o dañar los HIOs. Perforar el HIO con la punta de microcapillary. La superficie externa de la HIO se oprimirá ligeramente como la microcapillary comienza a presionar y aparecerá nuevamente dentro de forma que la punta penetra el lumen. Puede ser difícil identificar la punta de la microcapillary dentro del lumen HIO. Ajuste el iluminación o ampliación del disección alcance si hay dificultad para ver la microcapillary. Retire las manos de los controles de instrumental quirúrgico cuando la microcapillary es colocada correctamente con la punta de la microcapillary cerca del centro del HIO. Presionar la jeringa de aceite mineral levemente para empujar la solución de la microinyección de la microcapillary y en el lumen HIO. El HIO puede aumentar ligeramente para acomodar el volumen de la inyección.Nota: tenga cuidado para evitar llenar demasiado el HIO ya que esto causará el organoide a punto de estallar. Como regla general, dilatación visible del volumen HIO significa que es tiempo de parar. El volumen medio de la luz de la madura HIO es aproximadamente de 1 μl, pero puede variar significativamente. Automatizado de jeringa bombas pueden usarse en lugar de una jeringa manual para permitir el control fino del volumen inyectado. Retirar el microcapillary de HIO con el control del eje z y la posición sobre la superficie de los medios de comunicación. Hacia el próximo objetivo HIO con el microcapillary colocado sobre los medios de comunicación para evitar daños accidentales a los HIOs durante maniobras e inyectar de manera similar (ver pasos 3.6-3.11). Vuelva a llenar el microcapillary utilizando el enfoque descrito anteriormente.Nota: Si la punta se rompe en cualquier punto durante la microinyección, intentar continuar las inyecciones. Cambiar la punta según las instrucciones de abajo. Cambiar el microcapillary entre los tratamientos o en caso de rotura. Afloje la abrazadera en el extremo del brazo baloncesto suelo y quitar el microcapillary del titular de la micropipeta.PRECAUCIÓN: No manipule el microcapillary cerca del extremo agudo. El punto fino de la microcapillary es extremadamente afilado y fácilmente perfore piel y guantes. Tenga cuidado y ser consciente de todos los movimientos, manejo de la microcapillary utilizando el manipulador solamente y nunca colocar las manos entre el punto de la microcapillary y las culturas HIO. Buscar tratamiento médico inmediatamente en caso de un pinchazo de un microcapillary que contenga agentes infecciosos o toxinas.Nota: En algunos casos, puede ser difícil confirmar visualmente exitosa microinyección de HIO. La visibilidad de las suspensiones de microinyección claro puede mejorarse por medio de la adición de altas concentraciones de FITC-los dextranos. 4. farmacológico tratamiento de HIOs Para probar compuestos entregados al epitelio apical, resuspender en PBS estéril que contiene 2 mg/mL FITC-los dextranos y microinject en el lumen HIO como se indicó anteriormente (sección 3). Para el experimento representativo, resuspender toxina de Clostridium difficile TcdA a 12.8 ng/μl de PBS con FITC-los dextranos. Para probar compuestos entregados al compartimiento basolateral, sustituir los medios de cultivo exterior con nuevos medios de comunicación que contiene 2 mM el glicol de etileno-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N’, N’-ácido tetraacético (EGTA)(positive control), vehículo de PBS solo (control negativo ), u otro compuesto experimental después de la microinyección de FITC-los dextranos.Nota: La dosificación y momento de la aplicación de compuestos farmacológicos, toxinas u otros agentes pueden variar según la pregunta experimental. 5. proyección de imagen de organoides microinyectados en vivo Comenzar en proyección de imagen microinyección inmediatamente después. Transferir las placas de cultivo a un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara humidificada mantenida a 37 ° C y 21% de O2 y 5% CO2 con un celular directo automatizado sistema de imagen. Cerrar la cámara y comenzar el proceso de proyección de imagen. Inicie el software de análisis de imagen (por ejemplo, softWoRx) desde el escritorio. Haga clic en “Archivo” y seleccione “Adquisición (resolución 3D)” para iniciar la proyección de imagen y software de control de microscopio. Sistema de excitación/emisión a FITC (475 nm excitación/523 nm emisión), ajustar la potencia de transmisión al 5% y el objetivo a 4 X. Establecer el tiempo de exposición a 0,025 m (Figura 4A).Nota: El tiempo de exposición se debe variar para adaptarse a la intensidad de la señal fluorescente. En general, sólo se reducirá la señal de fluorescencia FITC. Por lo tanto, para garantizar la máxima sensibilidad, los tiempos de exposición inicial deben ser ajustados tal que la señal fluorescente grabada es justo debajo de la saturación de la cámara y el software de imágenes. Encontrar los HIOs en 4 aumentos usando el controlador digital conectado al microscopio. Centro de HIO en la observación de campo (Figura 4A). Haga clic en “Ver” en la barra de herramientas y seleccione “Punto lista” para revelar una nueva ventana. Haga clic en “Marcar” para almacenar la posición actual de la etapa en la lista de puntos (Figura 4A). Repita los pasos 5.4 y 5.5 hasta que se han registrado las posiciones de los HIOs. Usando un bloc de notas o registro digital, anote el número de identificación único asignado a cada posición programada de la microscopía y las imágenes captadas en esa posición. Los archivos de imagen serán marcados con este número de identificación y será importante asociar números de identificación de imagen específico HIOs y tratamientos después de la recolección de datos. Para iniciar la colección de imágenes automatizado, haga clic en “Archivo” y luego “Experimento” en la barra de herramientas. El experimento con la fecha o nombre único otro nombre. Definir los parámetros para la colección de imágenes pasando por cada una de las pestañas de opción como se muestra en la Figura 4B. Deseleccione “Seccionamiento de Z” en la pestaña “Seccionado”. En la pestaña “Canales”, introduzca los parámetros de la ventana superior izquierda “resolver 3D”. Para ahorrar tiempo, la primera fila se poblará automáticamente cuando se marca la casilla a la izquierda. La sección de ‘ Time-lapse “, seleccione la casilla”Tiempo transcurrido”y entrar en el intervalo de tiempo entre imágenes en la fila rotulada”Time-lapse”y la duración total del experimento en la fila con la etiqueta”Tiempo Total”. El software automáticamente calcula el número de puntos del tiempo. En la pestaña “Puntos”, seleccione la casilla “Lista de puntos de visita”.Puede introducir también manualmente el número de punto específico para ser incluidos en el experimento, escribiendo en el cuadro de texto. No cambie las opciones por defecto en las pestañas “Paneles” o “Acciones”. Haga clic en la ficha de “Run” entrar la fecha del experimento en la caja con la etiqueta “nombre de archivo de imagen” y establece los datos de ubicación en “Configuración” de almacenamiento. Haga clic en la flecha verde para ejecutar la macro experimento. Un contador de lapso de tiempo seguir el progreso experimental. Al final del curso del tiempo previsto, exportar y guardar todos los archivos de imagen como imágenes de TIFF RGB de 24 bits (figura 4). En la barra de herramientas, seleccione el proceso seguido por el generador de tareas. En el menú tarea de constructor, navegando por la carpeta de datos especificada en 5.9 para agregar archivos. Resaltar todos los archivos que terminan en “.dv” escribiendo “*.dv” en el símbolo del sistema. Seleccione todas (Ctl + A) y haga clic en “Agregar”. Haga clic en + en la sección denominada “Tarea”. Selecciona “Exportar como…” y haga clic en la pestaña de “Opciones”. Establecer “Formato de exportación” a “Imágenes de TIFF” y marque la casilla de abajo para agregar una “carpeta de salida de aduana”. Este es el lugar donde se exportarán las imágenes TIFF. Seleccione RGB de 24 bits en “Tipo de salida TIFF” y haga clic en “Hecho”. Haga clic en “Enviar a la cola” para ejecutar la Macro de exportar. Copiar las imágenes TIFF exportadas en 5.11 a un controlador externo o servidor si realizando el análisis de la proyección de imagen (sección 6) en un equipo diferente.Nota: El tejido HIO y medios de comunicación se pueden almacenar por histología34,35de PCR), Western blot36y otros análisis posteriores. 6. Análisis de la imagen Asegúrese de que ImageJ37 instalada y funcionando correctamente en el equipo que se utilizará para el análisis.Nota: Fiyi37 es una distribución alternativa del programa ImageJ core que funcionará igual de bien para este análisis. Iniciar el análisis de lote seleccionando “Proceso” y luego “Batch” y finalmente “Macro” en el menú de ImageJ. Establece la entrada en el directorio que contiene las imágenes TIFF recolectadas durante el curso del tiempo experimental. Abra el archivo de macro ImageJ “thesholdmeasure.ijm” o directamente copiar y pegar el código de macro en la ventana. Haga clic en el “Proceso” para comenzar a procesar los archivos.Nota: El umbral mínimo valor x (setThreshold(x,255);) se puede fijar a cualquier número de 0 – 255 y debe ajustarse con el fin de eliminar la fluorescencia del fondo. Valores < se recomiendan 100. Determinar empíricamente el valor umbral adecuado, ejecutar la macro imagen en una sola imagen representando un organoide con ninguna señal fluorescente. La intensidad media de esta imagen puede servir como una guía para el ajuste del umbral de forma adecuada. Para el análisis representativo presentado a continuación, el umbral se establece en “42”. ImageJ producirá una tabla grande que contiene el área de todos los píxeles dentro de la gama de intensidad umbral, y valoran de la media, mediana, mínimo y la intensidad máxima (límite) de la zona dentro de los límites de intensidad umbral. Guardar como CSV o XLS. Cambio en la intensidad con el tiempo puede ser computado en una hoja de cálculo39 mediante la manipulación de la tabla de datos para realizar el cálculo siguiente o puede ser automatizado usando un apropiado lenguaje de programación. Un guión de análisis de ejemplo escrito en R 40 es provisto de este manuscrito.Nota: Para cada HIO, intensidad de fluorescencia relativa puede ser cuantificada como . Eliminación tiempo 41 (t1/2) de FITC-los dextranos en el lumen HIO se calculó como sigue: En primer lugar, calcular el “área bajo la curva” (AUC) de la curva que describe la intensidad de fluorescencia relativa en el tiempo (t) como: Luego, calcular la “separación” () tasa con el volumen de distribución (Vd) definida como 1 para la fluorescencia normalizada en t = 0: A continuación, define la “constante de velocidad de eliminación” () como: Y finalmente, calcular el “tiempo de eliminación” (t1/2) como: La ecuación reducida es así: