人間の腸 Organoids 上皮関門の透過性のリアルタイム計測

通常、デ識別人間大人の腸組織は命の贈り物、ミシガン州で死亡したドナーから得られました。ヒト ES 細胞 H9 (NIH レジストリ #0062)-研究所から得られました。この作品で使用されているすべての人体組織は、非生体ドナーから得られた、解除識別され、ミシガン大学 IRB (プロトコル # HUM00093465 と HUM00105750) からの承認を得て実施しました。 (1) マイクロインジェクター セットアップ 材料表に掲げる材料を取得します。 キャビネット、バイオ セーフティにおけるマイクロマニピュレーター、切り裂くスコープ、光源を配置します。70% のエタノールまたは実験的使用する前に他の消毒剤とマイクロインジェクション セットアップをクリーニングします。漂白剤は、マイクロインジェクション装置を腐食する可能性がありますを含む消毒剤への長期暴露を避けます。注: 完全なマイクロインジェクター アセンブリの例は、図 1に示すです。 目の部分はバイオ セーフティ キャビネットのためシールドでアクセス ポートを使えるように切り裂くスコープを配置します。 また、バイオ セーフティ キャビネット顕微鏡アクセス ポイントの代わりに肯定的な気流方式のクリーン ベンチを使用します。 製造元の指示に従って顕微鏡の右側にあるマニピュレーターを組み立てるし、コントロールを簡単に到達し、調整することができますを調整します。マニピュレーターを鉄プレートにマウントするか、そうでなければ安定します。注: 左利きのユーザー可能性があります切り裂くスコープの左側にマニピュレーターを配置するとしています。 マニピュレーター アームにマイクロ ピペット ホルダーをマウント、ピペット ホルダーに挿入してアナログのチューブを接続します。 滅菌の鉱物油の約 5-7 mL と 10 mL のガラス製注射器を入力します。 満ちているルアーのロック メカニズムを使用してアナログの管の開放端に鉱物油 10 mL のガラス製の注射器を接続します。マニピュレーターから切り裂くスコープの左に向かいのガラス製注射器を配置します。 優しく注射器、チューブ内の鉱物油を押すを押します。ピペット ホルダーの先端から鉱物油の約 10 滴をフラッシュ シャーレまたは類似の容器で収集および破棄します。注: この手順はチューブからすべての空気を削除し、各マイクロインジェクション セッションの前に実行する必要があります。 2. マイクロインジェクションの準備 マイクロインジェクションの前に 24 h: FITC デキストラン ソリューションを準備するには、再滅菌 PBS または生理食塩水で 2 mg/mL の濃度で FITC デキストランを中断します。総量を準備 > 250 μ L。注: FITC デキストランの上位または下位の濃度が使用されます約至る 0.1 – 10 mg/mL。FITC-デキストラン下流イメージング アプリケーションに合わせて濃度を調整します。 4 または 8 よくチャンバー スライド ガラスまたは他の培養器に適したセットアップにおける文化は生きることと顕微鏡、まあ、50 μ L のセル ・ マトリックス ・ ソリューションに埋め込まれ、EGF、酒を飲むこと、R Spondin (ENR) 成長因子メディアの19 培養あたり 4-6 HIOs、24。リアルタイム イメージング分析中に顕微鏡単一のフィールドに複数の HIOs をキャプチャを避けるために均等に (約 5 mm 離れて)、オルガノイドのスペースに注意してください。HIO 文化、保守のための完全なガイドは、McCrakenらを参照してください。24。注: このプロトコル幹細胞由来 HIOs を使用して開発された、代表的な結果 (下記参照) は、この組織培養モデルの使用方法を示します。ただし、同じプロトコル組織由来腸管上皮 organoids15,29に適応します。組織由来 HIOs、PSC 派生 HIOs と欠如サポート間葉系基底細胞構造15,29,30より通常小さくなります。HIOs の組織由来の可能性が高い技術力を必要として経験します。HPSC 派生 HIOs と関係して上皮バリア透過性データ組織由来 HIOs を使用して取得する程度が知られています。 HIOs をマイクロインジェクション前に CO2を 42 ° C、5% で標準細胞文化のインキュベーターで孵化させなさい。 30 分前にマイクロインジェクション、オン、バイオ セーフティ キャビネットと最適な作業高さにガラスの盾を上げます。 バイオ セーフティ キャビネットからすべての不要な項目を削除します。クラッタ限られたスペースでの作業時の流出その他の事故のリスクが高まります。 スプレーし、70% のエタノールまたは他の消毒剤と作業面を徹底的に掃除します。紙タオルを使用してきれいに拭きます。 ガラスシリンジに接続されているガラス製注射器の鉱物油のレベルを確認します。残っている鉱物油の 3 mL よりも少ない場合、注射器を外し、バイオ セーフティ キャビネット、気泡を導入することに注意しながら中を補充します。7 mL 以上は記入しないでください。 解離の範囲を照らすランプを点灯します。個人的な快適さのための接眼レンズを調整します。 解離の範囲の右側にマイクロマニピュレーターを配置します。磁気スタンドを使用して鉄板をマイクロマニピュレーターを保護します。マニピュレーターの位置を調整し、マグネット スタンドを on に設定すると、鉄の板をスタンドに固定 OFF の位置にマグネット スタンドを切り替えます。 マイクロキャピ ラリー インストール 製造元によって提供されるストレージ コンテナーから単一 1 mm ガラス フィラメントを取得します。 マイクロ ピペットの引き手の銅加熱コイルの中心を通るガラス フィラメントを挿入します。注: は、ピペットの引き手を準備するためのガイドの図 2を参照してください。 銅加熱コイルは約ガラス フィラメント フィラメントを位置します。引き手が各ガラス フィラメントからの 2 つの使用可能なマイクロインジェクション針を生成するようになります。 上部を締めてクランプ クランプ最初、ガラス フィラメントが破損を防ぐための切欠きを有するグローブ内でセキュリティ保護されることを確かめて使用してガラス フィラメント安全します。 下部クランプを締める前に最大垂直位置に引く腕が伸びる。注意: この手順は重要です。引き手腕を伸展障害は、ガラス繊維の 2 つのセクションの不規則な分離になります。 メカニズムを引っ張って、冷暖房の設定を確認します。トグル (990) で熱 #1 を選択し、ぐいっと 059 (図 2) を設定します。 オン/オフのトグルを使用して計測器をオンにします。 保護プレキシ ガラスの盾を閉じるし、引き手の下右の顔のプル ボタンを押します。銅のコイルは熱を開始し、鮮やかなオレンジ色に光ります。温度が上昇すると、ガラス繊維を伸ばし、最終的に分離開始されます。ガラス繊維の 2 つの端の分離時に計測器が電源を切ります。メモ: 銅のコイルは、数分間非常に熱いままが。この時点でプロトコルの ‘マイクロキャピ ラリー’ として引っ張られたガラス フィラメントを参照します。 銅コイルに触れることを避けるため、ガラス microcapillaries の 1 つを削除するように注意すること。マイクロキャピ ラリー非常に細かい点が必要です。ラテックスやニトリル手袋と注意深くマイクロキャピ ラリーを処理し、すぐにマイクロインジェクター セットアップを含む安全キャビネットに進みます。注: ガラス マイクロキャピ ラリーは非常に鋭いと非常に壊れやすいです。取り扱いに注意。 マイクロマニピュレーター アームのエンド キャップを緩めます。ピペット ホルダーのオープン エンドに引っ張られたマイクロキャピ ラリーの鈍い端を挿入し、内側まで止まる押し込みます。 再エンド キャップを締め、マイクロマニピュレーターの腕にマイクロキャピ ラリーの鈍い端を固定します。注: インジェクション システムに、マイクロキャピ ラリーをインストールするときはシャープの端に触れるように世話します。汚染のチャンスを減らす、マイクロインジェクションの細かい点を保持します。正しく、マイクロキャピ ラリーを確保するため失敗はマイクロインジェクション中に不安定またはガラス繊維の破損につながります。 ガラス マイクロキャピ ラリーのヒントを開きます。引っ張られたガラス マイクロキャピ ラリーの準備時にポイントの先端が、マイクロキャピ ラリーの先の尖った端を密封するように溶ける可能性があります。この閉塞を削除: する この表面に触れることがなく切り裂くスコープのガラス ステージで、マイクロキャピ ラリーは下向きにマニピュレーターを移動します。 滅菌プラスチック表面を見つける (文化板蓋の下側は完全に動作します) と解離の範囲のステージでマイクロキャピ ラリー針の下に直接顕微鏡ステージ上に置きます。 表示領域の下でマイクロキャピ ラリーの先端を中心し、下 1.5 倍の倍率の顕微鏡の接眼レンズを通して見るとき、それが表示されていることを確認します。 マニピュレーター アームを進めるマイクロマニピュレーター コントロールを使用してゆっくりと先端はほとんどプラスチックの表面と、マイクロキャピ ラリーの先端を接触するまで滅菌プラスチック文化蓋に向かってマイクロキャピ ラリー休憩無料。注: は、マイクロインジェクション中、HIO への被害を最小限にするためにガラス繊維からの流体の流れは、最小の可能な休憩を目指してください。 続行する前に誤って破損の可能性を最小限に抑えるため滅菌表面かマイクロキャピ ラリーをバックアップします。 ガラス製注射器、チューブ内の鉱物油を押すを押すことによって流れのマイクロキャピ ラリーを確認してください。マイクロキャピ ラリーの最後が開かれている場合は、数秒後、マイクロキャピ ラリーの先端から出てくる鉱物油の小さな滴が表示されます。これが発生しない場合は、前の手順と再テストを繰り返します。 3. 滅菌マイクロインジェクション 注: 一度、マイクロキャピ ラリーは、準備、インストール、およびテストされている、マイクロインジェクション HIOs を開始します。図 3は、組織由来 HIO が正常に挿入されたかを FITC デキストランとを示しています。 注入材料で、マイクロキャピ ラリーを埋めます。側面または管の底に対してマイクロキャピ ラリーの先端を破損しないように注意しながら、FITC デキストラン注入停止ガラス マイクロキャピ ラリーの先端を沈めます。ソリューションに、マイクロキャピ ラリーの先端を浸漬すると、一度、マイクロキャピ ラリーに FITC デキストラン懸濁液の約 10 μ L を描画する鉱物油注射器を引いてください。注: これらがインストールされているマイクロキャピ ラリーに最も簡単にアクセスされるので、注入ソリューション/文化に 1.5 mL または 0.5 mL チューブを使用することをお勧めします。また、滅菌シャーレや滅菌のパラフィルムでチューブを保持する必要がありますを制限することによってシャープに傷害のチャンスを減らすことからソリューションを描画できる注入は、マイクロキャピ ラリーに近接します。懸濁液は非常に粘性、マイクロキャピ ラリーの開口部が非常に小さい場合、マイクロキャピ ラリーに合わせて 2 番目がかかる可能性がある場合。これは全体のインジェクション システムを汚染する可能性があります、マイクロインジェクションのプラスチック チューブにマイクロインジェクション懸濁液を描画しません。 マイクロインジェクション サスペンションがガラス マイクロキャピ ラリーの長さの 90% を満たすとき、マイクロキャピ ラリーを充填を停止します。若干、マイクロキャピ ラリーの先端に空気のポケットが含まれていないことを確認するマイクロインジェクション ソリューションから、マイクロキャピ ラリーを撤退する前に注射器を押します。注: 場合、マイクロキャピ ラリーの試験では、空気のポケットを明らかにする、空に、再入力します。 ガラスシリンジと細胞培養インキュベーター転送からバイオ セーフティ キャビネットに HIO 文化プレートを削除します。 図 2 安全キャビネット内で HIO 培養プレートから蓋を外し、最低倍率のスコープの接眼レンズを通して明確に表示されるように、顕微鏡ステージ上最初の井戸を中心します。 角度で HIO 文化に、マイクロキャピ ラリーを挙げられるようにマイクロマニピュレーター腕を回す > 顕微鏡ステージに対して 45 °。細かいコントロール (ブラック ダイヤル) の限られた範囲を持っているので、水平マイクロマニピュレーター アーム サポートが垂直スタンドを満たす時点で水平軸方向のマニピュレーター アーム組立部品を手動で回してこれは、最も簡単にモーション。メディア (図 3 a) の表面の上約 1 cm にも最初の文化上マイクロキャピ ラリーの先端を配置します。図 3Bの組織由来腸管上皮オルガノイドのマイクロインジェクションを示す代表的な画像が表示されます。 ガラス フィラメントの先端に、HIO(s) が接眼レンズを通して表示されることを確認します。必要に応じてを再配置します。 Z 軸制御ノブを時計回りに回して、マイクロキャピ ラリーをゆっくりと前進します。注: マイクロキャピ ラリー チップの位置を判断すると、特に深さ、練習が必要です。先端メディアの表面に違反、マイクロキャピ ラリー チップのわずかな視覚的歪みに気づきます。培養プレートの底面に対してマイクロキャピ ラリーを破損したり、HIOs の損傷を避けるためにこのポイントから注意して進めてください。 マイクロキャピ ラリー チップ HIO に穴を開けます。HIO の外側の表面は、マイクロキャピ ラリー圧力を適用するを開始し、先端が内腔を貫通形に戻ってポップアップ表示されます少し押し下げるでしょう。HIO 腔内マイクロキャピ ラリーのヒントを識別するために困難になる可能性があります。マイクロキャピ ラリーを見て問題がある場合は、解離の範囲の照明または倍率の設定を調整します。 マイクロキャピ ラリーが正しく、HIO の中心に近いマイクロキャピ ラリーの先端で置かれたとき、手をマイクロマニピュレーター コントロールから削除します。 若干、マイクロキャピ ラリーと HIO 内腔にマイクロインジェクション ソリューションをプッシュする鉱物油注射器を押します。HIO わずか注入量に合わせて展開すること。注: 過剰バースト organoid しまうので、HIO を充填しないように注意してください。親指のルールとして HIO ボリュームの任意の目に見える拡大しを停止する時間です。成熟した HIO 内腔の平均の容積は約 1 μ L が大幅に異なる場合があります。自動注射器のポンプは、噴射量の細かい制御を許可する手動の注射器の代わりに使用することがあります。 Z 軸コントロールとメディアの表面上の位置を使用して HIO から、マイクロキャピ ラリーを撤回します。 操縦中に、HIOs に偶発的な損傷を避けるために、同様の方法で注入メディア上に配置マイクロキャピ ラリーで HIO の次のターゲットに移動 (3.6 3.11 手順を参照)。 上記で説明したアプローチを使用してマイクロキャピ ラリーを補充します。注: 場合先端は、マイクロインジェクション中の任意の時点で中断、しないで注射を続けます。次の手順に従ってヒントを変更します。 マイクロキャピ ラリー治療の間または破損が発生した場合に変更します。マイクロマニピュレーターの腕の端にクランプを緩め、ピペット ホルダーから、マイクロキャピ ラリーを取り外します。注意: 鋭い端近くマイクロキャピ ラリーを処理しません。マイクロキャピ ラリーの罰金のポイントは非常にシャープで、簡単に手袋や皮膚に穴をあけます。注意し、だけ、決して、マイクロキャピ ラリー ポイントと HIO 文化間手を配置するマニピュレーターを用いたマイクロキャピ ラリーを取り扱い、すべての動きに注意してください。感染性病原体や毒素を含むマイクロキャピ ラリーから針棒が発生した場合すぐに治療を求めます。注: いくつかのケースでそれがあります成功 HIO マイクロインジェクションを視覚的に確認することは困難。FITC デキストランの高濃度添加による明確なマイクロインジェクション懸濁液の可視性を拡張できます。 4. HIOs 薬物療法 根尖部の上皮に配信される化合物をテストするためには、2 mg/mL FITC デキストランを含む滅菌 PBS に再懸濁し、HIO 内腔 (セクション 3) 上記のように microinject。代表的な実験は、FITC デキストランを含む PBS で 12.8 ng/μ L でのクロストリジウム ・ ディフィシル毒素 TcdA を再懸濁します。 置き換える外部文化メディア化合物基底外側コンパートメントに配信をテストするには、新しいを含むメディア 2 mM エチレング リコール-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N’, N’-四酢酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸)(positive control)、PBS は、単独で車 (ネガティブ コントロール)、または FITC デキストランのマイクロインジェクション後他の実験的化合物。注: 投与と薬理学的化合物、毒素、または他のエージェントの適用のタイミングは、実験の質問によると異なる場合があります。 5. ライブ Microinjected オルガノイドのイメージング ライブ イメージング直後マイクロインジェクションを開始します。自動ライブセル イメージング システムと 5% CO2と 21% O2 37 ° C で維持加湿チャンバを搭載した蛍光顕微鏡に培養皿を転送します。環境制御チャンバーを閉じて、イメージング プロセスを開始します。 デスクトップから画像解析ソフト (例えば、softWoRx) を起動します。「ファイル」をクリックし、「(解決 3 d) を獲得」イメージング顕微鏡制御ソフトウェアを初期化するを選択します。 励起/蛍光を FITC に設定 (475 nm 励起/523 nm 排出), 5% と 4 X レンズに送信電力を設定します。露出時間を 0.025 ms (図 4 a) に設定します。注: 露光時間は、蛍光シグナルの強さに合わせて変える必要があります。一般的には、FITC の蛍光信号が減少のみ。したがって、最大感度を確保するため記録された蛍光信号をカメラおよびイメージング ソフトウェアの飽和点より下だけに初期露出時間を調整する必要があります。 デジタル コント ローラーを顕微鏡を使って 4 倍の倍率で、HIOs を見つけます。表示フィールド (図 4 a) 内で HIO を中心します。 ツールバーの「表示」をクリックし、「ポイント リスト」を選択新しいウィンドウを明らかにします。「ポイントをマーク」をクリックしてポイントの一覧 (図 4 a) のステージの現在の位置を格納します。 5.4 と 5.5 の手順を繰り返して、すべて HIOs の位置が記録されています。メモ帳またはデジタル レコードを使用して、各プログラムの顕微鏡の位置とその位置で撮影された画像に割り当てられたユニークな ID 番号をメモしておきます。この ID 番号を持つ、タグ付きのイメージ ファイルとデータの収集が完了した後、特定 HIOs と治療イメージ ID 番号を関連付けることが重要ででしょう。 自動画像収集をセットアップするには、ツールバーの「ファイル」をクリックし、”実験”をクリックしてします。名前、日付または別の一意の名前を使用して実験。 図 4 bに示すように、各オプションのタブを経由してイメージのコレクションのパラメーターを設定します。 国連チェック タブの下「Z 区分”「断面」. 「チャンネル」タブの下には、トップ左「解決」3 d ウィンドウからパラメーターを入力します。時間を節約するには、最初の行は、左側のボックスをオンに自動的に表示されます。 タブの下「コマ撮り」、チェック ボックスをオン「経過時間」、「タイムラプス」と「時間」というラベルの付いた行に実験の合計期間というラベルの付いた行の画像間の時間間隔を入力します。ソフトウェアは、タイム ポイントの数を自動的に計算されます。 「ポイント」タブの下の「訪問ポイント リスト」をラベルをオンにします。また、手動でテキスト ボックスに入力して、実験に含まれる特定のポイント数を入力します。 「パネル」または「操作」タブの下の既定のオプションは変更しないでください。 「実行」タブを入力してくださいボックスで実験の日付をクリックして「画像ファイル名」というラベルの付いたし、保存場所は「設定」の下で、データを設定します。 実験のマクロを実行する緑色の矢印をクリックします。時間経過カウンターは実験の進行状況を追跡します。 予定時間のコースの終わりには、エクスポートし、24 ビット RGB TIFF イメージ (図 4) としてすべての画像ファイルを保存します。 ツールバーのタスク ビルダーのプロセスを選択します。 タスク ビルダー メニューで 5.9 で指定されたデータ フォルダーに移動してファイルを追加します。プロンプトで”*.dv”を入力して”.dv”で終わるすべてのファイルを強調表示します。すべて (Ctl + A) を選択し、「追加」をクリックします。 +「タスク」というラベルの付いたセクションの下をクリックします。「エクスポート…」を選択し、「オプション」タブをクリックしますします。 「TIFF 画像」「エクスポートの形式」、「カスタム出力フォルダー」を追加するには下ボックスを確認します。これは、TIFF イメージのエクスポート先の場所です。「TIFF 出力タイプ」の下で 24 ビット RGB を選択し、、「完了」をクリックします。 エクスポートのマクロを実行する「キューに送信」をクリックします。 別のコンピューターで後の画像解析 (セクション 6) を実行する場合のサーバーまたは外部ドライバー 5.11 でエクスポート TIFF イメージをコピーします。注: HIO 組織やメディアが格納される組織学34, PCR35)、西36、またはその他のダウン ストリーム解析のしみ。 6. 後イメージングによる解析 ImageJ37がインストールされていることを確認し、分析に使用するコンピューターで正しく動作します。注: フィジー37は動作する ImageJ コア ・ プログラムの代替配信この分析にも同様します。 ImageJ メニューから「プロセス」し、”バッチ”と最後に”マクロ”を選択してバッチ分析を開始。 実験の経過中に収集された TIFF イメージが含まれるディレクトリへの入力を設定します。”Thesholdmeasure.ijm”ImageJ マクロ ファイルを開くか直接コピー/貼り付けマクロ コード ウィンドウにします。「プロセス」のファイルの処理を開始するをクリックします。注: 最小しきい値値x (setThreshold(x,255);) が 0 – 任意の数に設定できます 255 と背景の蛍光性を排除するように調整する必要があります。値 < 100 をお勧めします。経験的適切なしきい値を判断、蛍光信号 organoid を表す単一のイメージのイメージングのマクロを実行します。この画像の平均輝度は、しきい値を適切に設定するためのガイドとして使用できます。以下に示す代表的な解析、しきい値は「42」に設定しました。 ImageJ は閾値強度範囲内のすべてのピクセルの領域を含む大きなテーブルを生産し、平均、中央値、最小と最大 (上限) 強度限界強度値の範囲内の領域に対応する値します。CSV や xls ファイルとして保存します。 時間の経過とともに強度の変化は、以下の計算を行うデータ テーブルを操作することでスプレッドシート39に計算できるまたは言語プログラミング自動を使用して適切なすることができます。40 R で書かれたスクリプトの例分析はこの原稿で提供されます。注: 各 HIO の相対的な蛍光強度が定量化することとして。除去時間41 (t1/2) デキストラン投与により HIO ルーメンでは、次のとおり算出されました。 まず、「曲線下面積」を計算 (AUC) として時間 (t) をかけて相対蛍光強度を記述する曲線から。 「クリアランス」を計算 () tで正規化された蛍光性ための 1 として定義されている分布 (Vd) 容積率 = 0。 次に、「消失速度定数」を定義 () として。 最後に、「除去時間」を計算し (t1/2) として。 減らされた式はこうです。