Summary

Сотовый агрегации анализов для оценки привязки дрозофилы паз с транс-лигандов и его ингибирование СНГ-лигандами

Published: January 02, 2018
doi:

Summary

Сложность систем в естественных условиях делает его трудно отличить активации и торможения рецептора Notch транс– и СНГ-лигандов, соответственно. Здесь мы представляем протокол, основанный на в пробирке клеток агрегации анализов для качественного и полуколичественного оценки привязки дрозофилы Notch транс-лигандов против СНГ-лигандами.

Abstract

Вырезка сигнализации является эволюционно сохранены ячеек системы связи, широко используется в развития животных и взрослых обслуживания. Взаимодействие рецептора Notch с лигандами из соседних клеток вызывает активацию сигнальный путь (транс-активации), в то время как взаимодействие с лигандами из той же клетке подавляет сигнализации (СНГ-торможение). Надлежащий баланс между транс-Активация и СНГ-ингибирование помогает создавать оптимальные уровни Notch сигнализации в некоторых контекстах во время развития животных. Из-за перекрывающихся выражений домены Notch и его лигандов во многих типах клеток и существование механизмов обратной связи, изучению влияния данного столб-поступательные изменения на транс– против СНГ-взаимодействий выемки и его лигандов в естественных условиях трудно. Здесь мы описываем протокол для использования дрозофилы S2 клеток в клетки агрегации анализов для оценки последствий стучать вниз паз путь модификатор в привязке паз для каждого лиганда в транс и в СНГ. S2 клетки стабильно или временно transfected с Notch выражая вектора смешиваются с клетками, выражая каждый паз лиганда (S2-Дельта или зазубренными S2). Транс-связывание рецептора и лигандами приводит к образованию агрегатов гетеротипичной клеток и измеряется количество агрегатов на мл, состоящий из > 6 клеток. Для изучения тормозящий эффект СНГ-лигандов, S2 клетки совместно выражая Notch и каждого лиганда смешиваются с S2-Дельта или S2-зазубренными клеток и количество агрегатов количественно как описано выше. Относительное сокращение числа агрегатов благодаря наличию СНГ-лигандов представляет собой меру СНГ-лиганд-опосредованной ингибирование транс-привязки. Эти просто анализов может обеспечить полу количественные данные о воздействии генетических или фармакологических манипуляций в привязке выемки его лигандов и может помочь расшифровка молекулярные механизмы, лежащие в основе в естественных условиях эффекты Подобные манипуляции на выемку сигнализации.

Introduction

Канонические Notch сигнализации является механизм ближней связи к ячейке, который требует физический контакт соседних клеток для облегчения взаимодействия между Notch рецепторов и их лиганды1. Взаимодействие с лигандами рецептора Notch (присутствует на поверхности клеток приема сигнала) (на поверхности отправки сигнала клетки) инициирует Notch сигнализации и известен как транс-активации2. С другой стороны, взаимодействие между Notch и его лигандов в той же ячейке приводит к ингибированию Notch путь и известен как СНГ-ингибирование3. Баланс между транс– и СНГ-взаимодействий необходим для обеспечения оптимальной лиганд зависимых Notch сигнализации4. Дрозофилы имеет один рецептора Notch и два лигандами (Дельта и Серрате) в отличие от млекопитающих, которые имеют четыре Notch рецепторов и пять лигандов [зубчатые 1 (JAG1), JAG2, 1 (DLL1), Дельта как DLL3 и DLL4]5. Имея это простота, дрозофилы модель предлагает простота учиться анализировать/эффекты модификаторы пути на паз лиганд взаимодействий и впоследствии Notch сигнализации. В некоторых контекстах во время развития животных (включая развитие крыла у дрозофилы), СНГ– и транс-взаимодействий участвуют для достижения надлежащего Notch сигнализации и клеточной судьба1,6 . Важно различать воздействия Notch путь модификаторов в этих контекстах на СНГ– против транс-взаимодействий паз с ее лигандами.

Наша группа ранее сообщалось, что добавление углеводный остаток, называется Ксилоза дрозофилы Notch отрицательно регулирует Notch сигнализации в определенных контекстах, включая крыло развития7. Потеря Шамс (фермента, xylosylates выемка) приводит к фенотип «потеря крыла вен»7. Совсем недавно гена дозировка экспериментов и клоновых анализа были использованы для показать, что потеря Шамс повышает выделение Дельта опосредованной Notch. Чтобы отличить ли расширение сигнализации паз в мутантов Шамс является результатом снижения СНГ-ингибирование или увеличение транс-активации, внематочная гиперэкспрессия исследования Notch лигандов в личиночной крыла имагинальных дисков с помощью dpp-GAL4 драйвера были исполнены. Эти эксперименты представила доказательства о том, что Шамс регулирует транс-активация Notch Дельта не затрагивая Notch СНГ-ингибирование лигандов8. Однако, обратной связи правила и эффекты эндогенного лиганда может усложнить толкование внематочная гиперэкспрессия исследования1,6,9.

Для решения этой проблемы, дрозофила S2 клетки10 были использованы, которые обеспечивают простой в vitro системы паз лиганд взаимодействия исследования11,12. S2 клетки не выразить эндогенного рецептора Notch и Дельта лигандом11 и Экспресс низкий уровень зубчатыми13, которая не влияет на паз лиганд агрегации эксперименты8. Таким образом S2 клетки могут стабильно или временно transfected Notch и/или отдельных лигандами (Дельта или Серрате) для генерации клеток, которые исключительно Экспресс рецептора Notch или один из его лигандов, или их комбинации. Смешивание Notch выражая S2 клеток с лигандом выражая S2 клеток приводит к образованию гетеротипичной агрегатов, при посредничестве рецептор лиганд привязки11,12,14. Количественная оценка совокупного образования представляет собой меру транс-привязки между Notch и его лигандов15 (рис. 1). Аналогичным образом, S2 клетки могут быть совместно transfected с Notch и Дельта или Серрате лигандами (т.е. СНГ-лигандами). СНГ-лигандов в этих клетках Notch выражая S2 отменить привязку паз с транс-лигандов и результат в снижение совокупного формирования8,12,14. Относительное уменьшение совокупного формирования, вызванных СНГ-лигандов представляет собой меру тормозящий эффект СНГ-лигандов на привязку между Notch и транс-лигандами (рис. 2). Соответственно, анализов агрегации клеток были использованы для изучения влияния потери xylosylation на транс– и СНГ-взаимодействий между Notch и его лигандами.

Здесь мы представляем подробный протокол для анализов агрегации клеток, направленных для оценки привязки паз с транс-лигандов и его ингибирование СНГ-лигандов с использованием дрозофилы S2 клеток. В качестве примера, мы предоставляем данные, которые позволили нам определить эффект xylosylation паз на привязку между Notch и транс-Дельта8. Эти просто анализы полуколичественного оценку Notch лиганд взаимодействий в пробирке и помочь определить молекулярные механизмы, лежащие в основе эффекты в vivo Notch путь модификаторов.

Protocol

1. Подготовка двойной мель РНК (dsRNA) Шамс нокдаун Амплификации PCR продукции Используйте одичал тип Желтый Белый (y w) геномной ДНК и pAc5.1-EGFP как шаблон и следующие пары праймера для того чтобы усилить фрагментов ДНК используется в синтезе двуцепочеч?…

Representative Results

Наши замечания в естественных условиях предложил увеличить потерю результатов Шамс гена xylosyltransferase в прирост Notch сигнализации Дельта опосредованной транс-активация паз не затрагивая СНГ-ингибирование Паз на лигандов8. Чтобы проверить …

Discussion

Канонические Notch сигнализации зависит от взаимодействия между рецептора Notch и его лигандов5. Хотя большинство исследований на пути Notch прежде всего рассмотреть связывание Notch и лигандами в соседних клетках (транс), паз и же элементная лиганды взаимодействуют и эти так н…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы признают поддержки от NIH/NIGMS (R01GM084135 HJN) и Фонд Мидзутани Glycoscience (Грант #110071 HJN) и благодарны том V. ли для обсуждения и предложения на анализы и Spyros Artavanis-Tsakonas, Хьюго Беллен, Роберт Флеминг, Кен Ирвин и центр ресурсов дрозофилы геномики (НАУЧНЫМ) для плазмидов и клеточных линий.

Materials

BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified Lonza 04-351Q
HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution GE Healthcare lifescience  SV30010
CELLSTAR 6 well plate Greiner Bio-One 657 160
CELLSTAR 24 well plate Greiner Bio-One 662160
VWR mini shaker Marshell Sceintific 12520-956
Hemocytometer Fisher Sceintific  267110
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311
MEGAscrip T7 Transcription Kit Ambion AM1334
Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) Zymo Research R1054
VistaVision Inverted microscope VWR
9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software AmScope MU-900 Image acquisition using ToupView software
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K210012
Fetal Bovine Serum GenDepot F0600-050
Methotrexate Sigma-Aldrich A6770-10
Hygromycin B Invitrogen HY068-L6
Copper sulphate Macron Fine Chemicals 4448-02
S2 cells Invitrogen R69007
S2-SerrateTom cells Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)
S2-Delta cells DGRC 152
S2-Notch cells DGRC 154
pMT-Delta vector DGRC 1021 Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Serrate vector Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)
pMT-Notch vector DGRC 1022 Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFP Gift from Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit Applied Biosystem 1611091
TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) Applied Biosystem Dm02144576_g1  with FAM-MGB dye
TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) Applied Biosystem Dm02151827_g1 with FAM-MGB dye
Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system Applied Biosystem 4351405 96-well Block module

References

  1. de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).
  2. Fortini, M. E. Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation. Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).
  3. del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling. Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).
  4. Sprinzak, D., et al. Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states. Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).
  5. Kopan, R., Ilagan, M. X. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
  6. Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis. Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).
  7. Lee, T. V., et al. Negative regulation of notch signaling by xylose. PLoS Genet. 9 (6), e1003547 (2013).
  8. Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila. PLoS Genet. 13 (4), e1006723 (2017).
  9. Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila. Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).
  10. Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).
  11. Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
  12. Fleming, R. J., et al. An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling. Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).
  13. Saj, A., et al. A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network. Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).
  14. Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila. Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).
  15. Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling. J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).
  16. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  17. Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe. J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).
  18. Acar, M., et al. Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling. Cell. 132 (2), 247-258 (2008).
  19. Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions. Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).
  20. Yamamoto, S., et al. A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands. Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).

Play Video

Cite This Article
Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands. J. Vis. Exp. (131), e56919, doi:10.3791/56919 (2018).

View Video