Här presenterar vi ett protokoll för att få tre färger smFRET data och dess analys med en 3D ensemble dold Markovmodell. Med detta synsätt, kan forskarna extrahera kinetiska information från komplexa protein system, inklusive kooperativitet eller korrelerade interaktioner.
Singel-molekyl Förster resonans energiöverföring (smFRET) blivit en allmänt använd biofysiska teknik att studera dynamiken i biomolekyler. För många molekylära maskiner i en cellproteiner har att agera tillsammans med interaktion partner i en funktionell cykel för att fullgöra sin uppgift. Tillägget av två-färg till flera smFRET gör det möjligt att samtidigt söka mer än en interaktion eller conformationaländring. Detta inte bara tillför en ny dimension till smFRET experiment men det erbjuder också den unika möjligheten att direkt studera händelseförloppet och att upptäcka korrelerade interaktioner när du använder en immobiliserade prov och en totalreflexion fluorescens Mikroskop (TIRFM). Flerfärgade smFRET är därför ett mångsidigt verktyg för att studera Biomolekylär komplex på ett kvantitativt sätt och i en tidigare ouppnåeliga detalj.
Här visar vi hur att övervinna de särskilda utmaningarna som flerfärgade smFRET experiment på proteiner. Vi presenterar detaljerade protokoll för att erhålla data och extrahera kinetiska information. Detta inkluderar trace urvalskriterier, staten separering och återvinning av statens banor från bullriga data med hjälp av en 3D ensemble dold Markovmodell (HMM). Jämfört med andra metoder, återvinns den kinetiska informationen inte från dwell time histogram men direkt från HMM. Ramen för högsta sannolikheten tillåter oss att kritiskt utvärdera den kinetiska modellen och ge meningsfull osäkerheter för priserna.
Genom att använda vår metod heat shock protein 90 (Hsp90), kan vi särskilja nukleotid bindningen och de globala konfirmerande förändringarna av protein. Detta tillåter oss att direkt observera kooperativitet mellan två nukleotid bindande fickor Hsp90 dimeren.
Många proteiner uppfylla sin funktion i dynamiska komplex med andra molekyler, medieras av konfirmerande förändringar och övergående föreningar på ett brett spektrum av tidsskalor1,2,3. Kopplat till en extern energikälla (t.ex. ATP) dessa dynamiska interaktioner kan leda till riktningen i en funktionell cykel och slutligen bevara icke-jämvikt steady-state i en cell, en förutsättning för liv.
För att fullt förstå dessa molekylära maskiner, är en statisk Beskrivning styrs av strukturella studier inte tillräckligt. Dessutom är det viktigt att ha kunskap om den underliggande kinetiska modellen och bestämma de kinetiska konstanterna. Flera befintliga metoder tillåter forskare att studera dynamiken i binärt interaktioner mellan två molekyler av intresse, t.ex. ytan plasmon resonans, avslappningsmetoder med en spektroskopisk avläsning (t.ex. hoppa eller stoppas-flöde tekniker), och kärnmagnetisk resonans. Deras tillämplighet är dock oftast begränsad till enkla två-påstå-system (t.ex. en bunden och en obunden stat) på grund av den i genomsnitt inneboende till bulk experiment. I fall där fler stater eller intermediärer är inblandade, ger de bara en komplex blandning av konstanterna. Singel-molekyl metoder såsom optisk eller magnetisk pincett eller två-färg smFRET, dvs en givare och en acceptor fluorophore, med en yta-orörlig prov kan återställa konstanterna för alla observerade konfirmerande förändringar. Men när det gäller interaktioner som påverkar mer än en bindning webbplats, dessa metoder förbli begränsade och informationen på det möjliga samband mellan två (eller mer) samspelet kommer endast vara tillgänglig via indirekta slutsatser från en uppsättning experiment.
Flerfärgade smFRET4,5,6,7,8,9 erbjuder möjlighet att studera samspelet mellan dessa komponenter direkt, i realtid och under nära-fysiologiska villkor10. Detta tillåter en att undersöka exempelvis konformationsberoende bindningen av en ligand eller ett annat protein8,9,11. Den övergripande strategi som presenteras här är att märka proteinernas sevärdheter på specifika positioner, bifoga ett protein på ytan av mätning kammaren, och att spåra fluorescensintensiteten över tid på en prisma-typ TIRFM (för detaljer se 9 , 12). den rumsliga närheten av de olika färgämnena kan sedan bestämmas från energiöverföring mellan dem. Märkning strategier kan variera från protein till protein (över 13) och riktlinjer för att undvika artefakter i smFRET mätningar finns14.
Eftersom givaren färgämne kan överföra energi till olika acceptor färgämnen i en multi-färg smFRET experiment, är den relativa positionen för alla färgämnen inte tillgänglig från excitation av ett färgämne ensam15,16. Men i kombination med omväxlande laser excitation (ALEX17och granskade i 18) denna metod ger alla plats och tid information på under en sekund och sub nanometers upplösning.
I rektor beräknade hög upplösning strukturell information kan uppnås med hjälp av avstånden mellan färgämne från kombinationen av alla fluorescens stödnivåer i en multi-färg smFRET experiment med ALEX. Men fokuserar här vi på statliga identifiering och separering samt utvinning av kinetiska modeller, där flerfärgade smFRET är oumbärlig. När ”bara” strukturbestämning av triangulering önskas, kan en uppsättning enklare tvåfärgad smFRET experiment med hög signal-brus-förhållande vara utförda12,19.
Vi använder den partiella fluorescensen () som en proxy för energiöverföring mellan två fluorophores7. PF beräknas från fluorescensintensiteten analogt med bandet effektiviteten av en två-färg experiment:
Där är intensiteten i utsläpp kanal em efter excitation med färg exoch c är acceptorn med längsta våglängden. Samma ståndpunkt upptäckt kanaler i provkammaren men spela in olika spektrala spänner av fluorescens ljuset. Samma identifierare för magnetisering och utsläpp används i detta protokoll (dvs, ”blå”, ”gröna” och ”röda”).
På grund av experimentella brister beror uppmätta fluorescens stödnivåer inte bara på energiöverföring utan även på fluorophore och setup egenskaper. För att erhålla sann energieffektiviteten överföring mellan två fluorophores, har de uppmätta stödnivåerna rättas. Följande procedur bygger på referens9. Korrektionsfaktorer för uppenbara läckage (lk, dvs detektion av fotoner från en fluorophore i en kanal utsetts för ett annat färgämne) och uppenbara gamma (ag, d.v.s. fluorescens kvantutbyte av färgämnet och upptäckt effektivitet av kanalen) erhålls från singel-molekyl spår som visar en acceptor blekning händelse.
Läckage av givare färgämnet i varje möjligt acceptor kanal beräknas från alla datapunkter i inspelade fluorescens spår där acceptor färgen blekt men givaren är fortfarande fluorescerande ():
Medianen av läckage histogrammet används som den skenbara läckage faktorn. Efter korrigering för läckage bestäms den skenbara gamma faktorn från samma uppsättning spår. Det beräknas genom att dividera ändringen av fluorescens i acceptor kanalen vid ändringen av fluorescens i kanalen givare vid blekning av acceptor färgen:
Där c är igen upptäckt kanalen för acceptorn med längsta våglängden. Medianen av den resulterande fördelningen används som uppenbart korrektionsfaktorn.
De korrigera stödnivåerna i varje kanal erhålls genom:
PF beräknas då enligt:
Olika populationer kan separeras i flerdimensionella utrymmet korsas av PFs. Position och bredd i varje medlemsstat bestäms av passande data med flerdimensionella Gaussisk funktioner. Efterföljande optimering av en global HMM baserat på alla PF spår ger en kvantitativ beskrivning av den observerade kineticsen. Även små förändringar av räntorna kan påvisas.
HMMs tillhandahåller ett sätt att dra slutsatsen att en stat modell från en samling av bullriga tid spår. Systemet anses vara i en av en uppsättning diskreta, dolda lägen vid varje given tidpunkt och faktiska observationen (dvs utsläpp) är en probabilistisk funktion av denna dolda stat20. När det gäller TIRFM smFRET data, kan den utsläpp sannolikheter bjag per stat jag modelleras genom kontinuerlig Gaussisk sannolikhetsdensiteten funktioner. Vid regelbundet fördelade diskret tidpunkter, kan övergångar från en till en annan stat uppstå enligt övergången sannolikheten att tajma-invariant och bara beror på det aktuella läget. Den övergången matrisen A innehåller dessa övergången sannolikheter enij mellan alla dolda lägen. Starttillstånd fördelningen ger delstatsspecifik sannolikheterna
för den första tiden en tid spårning. Med en maximal-sannolikheten metod, kan dessa parametrar optimeras för att bäst beskriva data med framåt-bakåt och Baum-Welch algoritmer20,21. Detta ger de högsta sannolikheten estimatorer (MLE). Slutligen, den statliga sekvens som troligen produceras banan för observationer kan utläsas med Viterbis algoritmen. I motsats till andra HMM analyser av smFRET data24,25,26 använder vi inte HMM som en enbart ”utjämning” av data men extraktet den kinetiska stat modellen från datauppsättningen utan behov för montering uppehållstid histogram27. HMM analys sker med egna skript med Igor Pro. Genomförandet av koden är baserad på referens21. Vi tillhandahåller en software kit och exemplarisk data på vår webbsida för att följa avsnitten 5 och 6 i detta protokoll (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). Fullständig programvara finns tillgänglig på begäran.
Tidpunkter i data med PF < -1 eller PF > 2 i någon upptäckt kanal tilldelas minimala utsläpp sannolikheten för alla stater (10-200). Detta förhindrar artificiella övergångarna på dessa datapunkter.
Parametrarna för utsläpp sannolikheterna erhålls från passformen i 3D PF histogrammet med Gaussisk funktioner som beskrivs i steg 5,7. Dessa parametrar hålls fast under optimering av HMM.
I den presenterade metoden används starttillstånd distribution vektorn och övergången matrisen globalt att beskriva hela ensemblen spår. De uppdateras baserat på alla N molekyler från datauppsättningen enligt referens27.
Startparametrar för starttillstånd fördelningen bestäms från 2D projektioner av PF histogrammet (steg 5.3) och övergångssannolikheter ställs till 0,05 med undantag av sannolikheterna i samma stat som väljs så att sannolikheten att lämna en viss stat är normaliserat till enighet.
En sannolikhet profilering metoden används för att ge konfidensintervall (CI) för alla övergången priser21,22, som tjänar som meningsfulla beräkningar för deras osäkerhet. För att beräkna gränserna för CI för en bestämd hastighet, fast övergången sannolikheten för intresse till ett annat värde än MLE. Detta ger den test modell λ’. En sannolikhet baserat (LR) test av sannolikheten tanke datauppsättningen 0 utförs enligt:
Den 95% konfidens bunden för parametern är nått när LR överskrider 3.841, den 95% quantile av en x2-distribution med en grad av frihet22,23.
Kraften i metoden demonstreras med Hsp90. Detta rikligt protein finns i bakterier och Eukaryoter och är en del av den cellulära stress svar28. Det är ett lovande läkemedel mål i cancer behandling29. Hsp90 är en homodimer med en nukleotid bindande ficka i den N-terminala domänen varje subenhet30. Det kan genomgå övergångar mellan minst två globalt olika konformationer, en stängd och en N-terminal öppen, V-formad konformation19,31,32. Dimeriskt natur väcker direkt frågan om samspelet mellan de två nukleotid bindningsställen i Hsp90.
I följande ger vi ett stegvisa protokoll för datainsamling och analys av tre färger smFRET experiment på jäst Hsp90 och nukleotid. Konformationsberoende bindningen av fluorescently märkt AMP-PNP (förstärkare-PNP *, en icke-hydrolyserbar analog av ATP) analyseras. Tillämpningen av förfarandet som beskrivs tillåter studiet av nukleotid bindningen och samtidigt konfirmerande ändringarna av Hsp90 och avslöjar därmed kooperativitet mellan två nukleotid bindande fickor Hsp90.
Vi presenterar det experimentella förfarandet för att erhålla tre färger smFRET data för en komplicerad protein system och en stegvis beskrivning av analysen av dessa mätningar. Denna metod erbjuder unika möjligheten att direkt bedöma korrelationen mellan flera interaktion platser eller konfirmerande förändringar.
För att erhålla lämpliga flerfärgade singel-molekyl data på proteiner är det viktigt att utföra reproducerbara mätningar på en låg ljudnivå. Detta kan uppnås ge…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansieras av den tyska forskningsfondens (INST 39/969-1) och Europeiska forskningsrådet genom om ERC bidragsavtalet n. 681891.
Setup | |||
vibration-damped optical table | Newport, Irvine, CA, USA | RS2000 | |
OBIS 473nm LX 75mW LASER | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1185052 | |
OBIS 532nm LS 50mW LASER | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1261779 | |
OBIS 594nm LS 60mW LASER | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1233470 | |
OBIS 637nm LX 140mW LASER | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1196625 | |
laser control unit | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1234465 | Scientific Remote |
aspheric telescope lenses | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | d=25.4mm, f=50mm and f=100mm | |
CF ex1 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZET 473/10 | cleanup filter excitation |
CF ex2 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZET 532/10 | cleanup filter excitation |
CF ex3 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZET 594/10 | cleanup filter excitation |
CF ex4 | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | FL635-10 | cleanup filter excitation |
DM ex1 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZQ594RDC | dichroic mirror excitation |
DM ex2 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 570DCXR | dichroic mirror excitation |
DM ex3 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZQ491RDC | dichroic mirror excitation |
AOTFnC-Vis | AA Opto-Electronic, Orsay, France | ||
λ/4 plate | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | AQWP05M-600 | |
CFI Apo TIRF 100x | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | high-NA objective | |
piezo focus positioner MIPOS 250 CAP | piezosystem jena GmbH, Jena, Germany | Piezo Controller NV 40/1 CLE | |
piezo stepper | Newport, Irvine, CA, USA | PZA12 | PZC200-KT NanoPZ Actuator Kit |
achromatic aspheric lenses | Qioptiq Photonics GmbH & Co. KG, Göttingen, Germany | G322-304-000 | d=50mm, f=200mm |
adjustable optical slit | Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany | 27.160.1212 | max. aperture 12 x 12 mm |
DM det1 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | T 600 LPXR | dichroic mirror detection |
DM det2 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | H 560 LPXR superflat | dichroic mirror detection |
DM det3 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | HC BS R635 | dichroic mirror detection |
BP det1 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 525/40 BrightLine HC | bandpass filter detection |
BP det2 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 586/20 BrightLine HC | bandpass filter detection |
BP det3 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 631/36 BrightLine HC | bandpass filter detection |
BP det4 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 700/75 ET Bandpass | bandpass filter detection |
optical shutters detection | Vincent Associates, Rochester, NY, USA | Uniblitz VS25S2T0 | |
EMCCD iXon Ultra 897 | Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland | ||
digital I/O card, PCIe-6535 | National Instruments, Austin, Texas, USA | ||
syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | PHD22/2000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Flow chamber | |||
quartz slides | G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA | Spectrosil2000, h=3mm | |
TEGADERM film | 3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany | 1626W | 10 x 12cm |
spray adhesive | 3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany | Photo Mount 050777 | |
glycerol | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | Immersol G | |
immersion oil | OLYMPUS EUROPA SE & CO. KG, Hamburg, Germany | IMMOIL-F30CC | |
prism | Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Germany | Suprasil1 | |
aluminium prism holder | custom built | ||
hollow setscrews | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | with custom drilling | |
Tygon S3 E-3603 tubing | neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | 2-4450 | ACF00001 |
PTFE tubing | Bohlender GmbH, Grünsfeld, Germany | S1810-08 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sample | |||
yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin | UniProt ID P02829 | ||
Maleimide derivatives of Atto488, Atto550 | ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany | ||
AMP-PNP* | Jena Bioscience, Jena, Germany | γ-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N | |
Fluospheres | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | F8764 | amine-modified, 0.2 μm, yellow-green fluorescent |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Andor Solis | Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland | version 4.30 | |
LabVIEW | National Instruments, Austin, Texas, USA | version 2012, 32bit; misc. hardware control | |
MDS control software | AA Opto-Electronic, Orsay, France | version 2.03a | |
Coherent Connection | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | version 3 | |
Igor Pro | WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA | version 6.37 |