Använda tre färger singel-molekyl bandet att studera korrelationen av proteininteraktioner

Många proteiner uppfylla sin funktion i dynamiska komplex med andra molekyler, medieras av konfirmerande förändringar och övergående föreningar på ett brett spektrum av tidsskalor^1,2,3. Kopplat till en extern energikälla (t.ex. ATP) dessa dynamiska interaktioner kan leda till riktningen i en funktionell cykel och slutligen bevara icke-jämvikt steady-state i en cell, en förutsättning för liv.

För att fullt förstå dessa molekylära maskiner, är en statisk Beskrivning styrs av strukturella studier inte tillräckligt. Dessutom är det viktigt att ha kunskap om den underliggande kinetiska modellen och bestämma de kinetiska konstanterna. Flera befintliga metoder tillåter forskare att studera dynamiken i binärt interaktioner mellan två molekyler av intresse, t.ex. ytan plasmon resonans, avslappningsmetoder med en spektroskopisk avläsning (t.ex. hoppa eller stoppas-flöde tekniker), och kärnmagnetisk resonans. Deras tillämplighet är dock oftast begränsad till enkla två-påstå-system (t.ex. en bunden och en obunden stat) på grund av den i genomsnitt inneboende till bulk experiment. I fall där fler stater eller intermediärer är inblandade, ger de bara en komplex blandning av konstanterna. Singel-molekyl metoder såsom optisk eller magnetisk pincett eller två-färg smFRET, dvs en givare och en acceptor fluorophore, med en yta-orörlig prov kan återställa konstanterna för alla observerade konfirmerande förändringar. Men när det gäller interaktioner som påverkar mer än en bindning webbplats, dessa metoder förbli begränsade och informationen på det möjliga samband mellan två (eller mer) samspelet kommer endast vara tillgänglig via indirekta slutsatser från en uppsättning experiment.

Flerfärgade smFRET^4,5,6,7,8,9 erbjuder möjlighet att studera samspelet mellan dessa komponenter direkt, i realtid och under nära-fysiologiska villkor¹⁰. Detta tillåter en att undersöka exempelvis konformationsberoende bindningen av en ligand eller ett annat protein^8,9,11. Den övergripande strategi som presenteras här är att märka proteinernas sevärdheter på specifika positioner, bifoga ett protein på ytan av mätning kammaren, och att spåra fluorescensintensiteten över tid på en prisma-typ TIRFM (för detaljer se ^{9 , 12}). den rumsliga närheten av de olika färgämnena kan sedan bestämmas från energiöverföring mellan dem. Märkning strategier kan variera från protein till protein (över ¹³) och riktlinjer för att undvika artefakter i smFRET mätningar finns¹⁴.

Eftersom givaren färgämne kan överföra energi till olika acceptor färgämnen i en multi-färg smFRET experiment, är den relativa positionen för alla färgämnen inte tillgänglig från excitation av ett färgämne ensam^15,16. Men i kombination med omväxlande laser excitation (ALEX¹⁷och granskade i ¹⁸) denna metod ger alla plats och tid information på under en sekund och sub nanometers upplösning.

I rektor beräknade hög upplösning strukturell information kan uppnås med hjälp av avstånden mellan färgämne från kombinationen av alla fluorescens stödnivåer i en multi-färg smFRET experiment med ALEX. Men fokuserar här vi på statliga identifiering och separering samt utvinning av kinetiska modeller, där flerfärgade smFRET är oumbärlig. När ”bara” strukturbestämning av triangulering önskas, kan en uppsättning enklare tvåfärgad smFRET experiment med hög signal-brus-förhållande vara utförda^12,19.

Vi använder den partiella fluorescensen () som en proxy för energiöverföring mellan två fluorophores⁷. PF beräknas från fluorescensintensiteten analogt med bandet effektiviteten av en två-färg experiment:

Där är intensiteten i utsläpp kanal em efter excitation med färg exoch c är acceptorn med längsta våglängden. Samma ståndpunkt upptäckt kanaler i provkammaren men spela in olika spektrala spänner av fluorescens ljuset. Samma identifierare för magnetisering och utsläpp används i detta protokoll (dvs, ”blå”, ”gröna” och ”röda”).

På grund av experimentella brister beror uppmätta fluorescens stödnivåer inte bara på energiöverföring utan även på fluorophore och setup egenskaper. För att erhålla sann energieffektiviteten överföring mellan två fluorophores, har de uppmätta stödnivåerna rättas. Följande procedur bygger på referens⁹. Korrektionsfaktorer för uppenbara läckage (lk, dvs detektion av fotoner från en fluorophore i en kanal utsetts för ett annat färgämne) och uppenbara gamma (ag, d.v.s. fluorescens kvantutbyte av färgämnet och upptäckt effektivitet av kanalen) erhålls från singel-molekyl spår som visar en acceptor blekning händelse.

Läckage av givare färgämnet i varje möjligt acceptor kanal beräknas från alla datapunkter i inspelade fluorescens spår där acceptor färgen blekt men givaren är fortfarande fluorescerande ():

Medianen av läckage histogrammet används som den skenbara läckage faktorn. Efter korrigering för läckage bestäms den skenbara gamma faktorn från samma uppsättning spår. Det beräknas genom att dividera ändringen av fluorescens i acceptor kanalen vid ändringen av fluorescens i kanalen givare vid blekning av acceptor färgen:

Där c är igen upptäckt kanalen för acceptorn med längsta våglängden. Medianen av den resulterande fördelningen används som uppenbart korrektionsfaktorn.

De korrigera stödnivåerna i varje kanal erhålls genom:

PF beräknas då enligt:

Olika populationer kan separeras i flerdimensionella utrymmet korsas av PFs. Position och bredd i varje medlemsstat bestäms av passande data med flerdimensionella Gaussisk funktioner. Efterföljande optimering av en global HMM baserat på alla PF spår ger en kvantitativ beskrivning av den observerade kineticsen. Även små förändringar av räntorna kan påvisas.

HMMs tillhandahåller ett sätt att dra slutsatsen att en stat modell från en samling av bullriga tid spår. Systemet anses vara i en av en uppsättning diskreta, dolda lägen vid varje given tidpunkt och faktiska observationen (dvs utsläpp) är en probabilistisk funktion av denna dolda stat²⁰. När det gäller TIRFM smFRET data, kan den utsläpp sannolikheter b_jag per stat jag modelleras genom kontinuerlig Gaussisk sannolikhetsdensiteten funktioner. Vid regelbundet fördelade diskret tidpunkter, kan övergångar från en till en annan stat uppstå enligt övergången sannolikheten att tajma-invariant och bara beror på det aktuella läget. Den övergången matrisen A innehåller dessa övergången sannolikheter en_ij mellan alla dolda lägen. Starttillstånd fördelningen ger delstatsspecifik sannolikheterna för den första tiden en tid spårning. Med en maximal-sannolikheten metod, kan dessa parametrar optimeras för att bäst beskriva data med framåt-bakåt och Baum-Welch algoritmer^20,21. Detta ger de högsta sannolikheten estimatorer (MLE). Slutligen, den statliga sekvens som troligen produceras banan för observationer kan utläsas med Viterbis algoritmen. I motsats till andra HMM analyser av smFRET data^24,25,26 använder vi inte HMM som en enbart ”utjämning” av data men extraktet den kinetiska stat modellen från datauppsättningen utan behov för montering uppehållstid histogram²⁷. HMM analys sker med egna skript med Igor Pro. Genomförandet av koden är baserad på referens²¹. Vi tillhandahåller en software kit och exemplarisk data på vår webbsida för att följa avsnitten 5 och 6 i detta protokoll (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). Fullständig programvara finns tillgänglig på begäran.

Tidpunkter i data med PF < -1 eller PF > 2 i någon upptäckt kanal tilldelas minimala utsläpp sannolikheten för alla stater (10^-200). Detta förhindrar artificiella övergångarna på dessa datapunkter.

Parametrarna för utsläpp sannolikheterna erhålls från passformen i 3D PF histogrammet med Gaussisk funktioner som beskrivs i steg 5,7. Dessa parametrar hålls fast under optimering av HMM.

I den presenterade metoden används starttillstånd distribution vektorn och övergången matrisen globalt att beskriva hela ensemblen spår. De uppdateras baserat på alla N molekyler från datauppsättningen enligt referens²⁷.

Startparametrar för starttillstånd fördelningen bestäms från 2D projektioner av PF histogrammet (steg 5.3) och övergångssannolikheter ställs till 0,05 med undantag av sannolikheterna i samma stat som väljs så att sannolikheten att lämna en viss stat är normaliserat till enighet.

En sannolikhet profilering metoden används för att ge konfidensintervall (CI) för alla övergången priser^21,22, som tjänar som meningsfulla beräkningar för deras osäkerhet. För att beräkna gränserna för CI för en bestämd hastighet, fast övergången sannolikheten för intresse till ett annat värde än MLE. Detta ger den test modell λ’. En sannolikhet baserat (LR) test av sannolikheten tanke datauppsättningen 0 utförs enligt:

Den 95% konfidens bunden för parametern är nått när LR överskrider 3.841, den 95% quantile av en x²-distribution med en grad av frihet^22,23.

Kraften i metoden demonstreras med Hsp90. Detta rikligt protein finns i bakterier och Eukaryoter och är en del av den cellulära stress svar²⁸. Det är ett lovande läkemedel mål i cancer behandling²⁹. Hsp90 är en homodimer med en nukleotid bindande ficka i den N-terminala domänen varje subenhet³⁰. Det kan genomgå övergångar mellan minst två globalt olika konformationer, en stängd och en N-terminal öppen, V-formad konformation^19,31,32. Dimeriskt natur väcker direkt frågan om samspelet mellan de två nukleotid bindningsställen i Hsp90.

I följande ger vi ett stegvisa protokoll för datainsamling och analys av tre färger smFRET experiment på jäst Hsp90 och nukleotid. Konformationsberoende bindningen av fluorescently märkt AMP-PNP (förstärkare-PNP *, en icke-hydrolyserbar analog av ATP) analyseras. Tillämpningen av förfarandet som beskrivs tillåter studiet av nukleotid bindningen och samtidigt konfirmerande ändringarna av Hsp90 och avslöjar därmed kooperativitet mellan två nukleotid bindande fickor Hsp90.