Uso del traste de una sola molécula a estudiar la correlación de las interacciones proteína

Muchas proteínas cumplen con su función en dinámicos complejos con otras moléculas, mediadas por cambios conformacionales y asociaciones transitorias en una amplia gama de escalas temporales^1,2,3. Junto a una fuente externa de energía (e.g., ATP) estas interacciones dinámicas pueden conducir a direccionalidad en un ciclo funcional y, en definitiva, mantener el estado estacionario de no equilibrio en una célula, el requisito previo para la vida.

Para entender completamente estas máquinas moleculares, no es suficiente una descripción estática guiada por los estudios estructurales. Además, es esencial tener conocimiento del modelo cinético subyacente y para determinar las constantes de tipo cinético. Varios métodos existentes permiten a los investigadores estudiar la dinámica de las interacciones binarias entre dos moléculas de interés, por ejemplo, resonancia de plasmón superficial, métodos de relajación con una lectura espectroscópica (por ejemplo, salto o flujo detenido técnicas) y resonancia magnética nuclear. Sin embargo, su aplicabilidad es en la mayoría de los casos que se limita a simples sistemas de dos Estados (por ejemplo, un límite y un estado independiente) debido a la inherente a los experimentos de mayor promedio. En los casos donde están involucrados más Estados o productos intermedios, rinden sólo una mezcla compleja de las constantes de velocidad. Métodos de una sola molécula como pinzas ópticas o magnéticas o smFRET bicolor, es decir, un donante y un fluoróforo aceptor, con una muestra de superficie inmovilizada pueden recuperar las constantes de velocidad para todos observar cambios conformacionales. Sin embargo, cuando se trata de interacciones que afectan a más de un enlace, estos métodos siguen siendo limitados y la información sobre las interacciones de la posible correlación de los dos (o más) sólo será accesible a través de conclusiones indirectas de un conjunto de experimentos.

SmFRET multicolor^4,5,6,7,8,9 ofrece la oportunidad de estudiar la interacción entre estos componentes directamente, en tiempo real y bajo condiciones fisiológicas cerca de¹⁰. Esto permite investigar por ejemplo, la Unión dependiente de la conformación de un ligando u otra proteína^8,9,11. El enfoque general que se presenta aquí es a etiqueta de la proteína de interés en posiciones específicas, para unir una proteína a la superficie de la cámara de medición y seguimiento de la intensidad de fluorescencia con el tiempo en un tipo de prisma TIRFM (para detalles ver ^{9 , 12}). la proximidad espacial de los diferentes tintes puede ser determinada luego de la transferencia de energía entre ellos. Etiquetado estrategias puede variar de proteína a proteína (revisada en ¹³) y directrices para evitar artefactos en smFRET medidas existen¹⁴.

Ya que un tinte de donantes puede transferir energía al aceptador diferentes tintes en un experimento de varios colores smFRET, la posición relativa de los colorantes no es accesible desde la excitación de un tinte solo^15,16. Pero en combinación con alternancia de excitación láser (ALEX¹⁷y ha comentado en ¹⁸) este método proporciona toda la información espacio-temporal en fracciones de segundos y resolución sub-nanométrica.

En principio, alta resolución información estructural se logra mediante el uso de las distancias entre tintes calcula a partir de la combinación de todas intensidades de fluorescencia en un experimento smFRET multicolor con ALEX. Sin embargo, aquí nos enfocamos en la identificación de estado y separación así como la extracción de modelos cinéticos, donde varios color smFRET es indispensable. Cuando se desea “sólo” determinación estructural mediante triangulación, un conjunto de experimentos de dos colores smFRET más simples con alta relación de señal a ruido puede ser realizado^12,19.

Utilizamos el parcial de la fluorescencia () como un proxy para la transferencia de energía entre dos fluoróforos⁷. El PF es calculado de la intensidad de fluorescencia similar a la eficacia de traste de un experimento de dos colores:

Donde, es la intensidad en el canal de emisión em después de excitación con color ex, y c es el aceptante con la longitud de onda más larga. Canales de detección representan la misma posición en la cámara de la muestra pero discos diferentes rangos espectrales de la luz de la fluorescencia. Utilizan el mismo identificador de excitación y emisión en este protocolo (es decir, “azul”, “verde” y “rojo”).

Debido a deficiencias experimentales las intensidades de fluorescencia medidos dependen no sólo en la transferencia de energía, sino también de propiedades fluoróforo y configuración. Para obtener la verdadera eficiencia de transferencia entre dos fluoróforos, las intensidades medidas tienen que corregirse. El siguiente procedimiento se basa en la referencia⁹. Factores de corrección para salida aparente (LC, es decir, la detección de fotones de un fluoróforo en un canal designada para otro tinte) y gamma aparente (ag, es decir, el rendimiento cuántico de fluorescencia del colorante y la eficiencia de la detección del canal) se obtiene de rastros de una sola molécula que muestran un aceptor evento de blanqueo.

La salida del tinte en cada canal de aceptador posible donante se calcula desde todos los puntos de datos en los rastros de fluorescencia grabado donde el tinte del aceptador de la blanqueada pero el donante es todavía fluorescente ():

La media del histograma de salida se utiliza como el factor de salida aparente. Después de la corrección de fugas, el factor gamma aparente se determina desde el mismo conjunto de rastros. Se calcula dividiendo el cambio de fluorescencia en el canal del receptor por el cambio de fluorescencia en el canal de donantes sobre la decoloración del tinte aceptador:

Donde c es otra vez el canal de detección para el aceptante con la longitud de onda más larga. La mediana de la distribución resultante se utiliza como el factor de corrección aparente.

Las intensidades corregidas en cada canal se obtienen por:

Luego se calcula el PF según:

Diferentes poblaciones pueden ser separadas en el espacio multidimensional atravesado por la s PF. La posición y la anchura de cada Estado se determina introduciendo los datos con funciones Gaussianas multidimensionales. Optimización posterior de un HMM global basado en los restos PF proporciona una descripción cuantitativa de la cinética observada. Incluso pequeños cambios de las tasas son detectables.

HMMs proporcionan una manera de inferir un modelo de estado de una colección de huellas de ruido tiempo. El sistema se considera en uno de una serie de discretos, Estados ocultos en cualquier momento y en la observación real (es decir, la emisión) es una función probabilística de este estado oculto²⁰. En el caso de los datos de TIRFM smFRET, la emisión probabilidades b por el estado puede ser modelados por funciones de densidad de probabilidad gaussiana continua. En los puntos regularmente espaciados de tiempo discreto, las transiciones de uno a otro estado pueden ocurrir según la probabilidad de transición que es tiempo-invariante y sólo depende del estado actual. La matriz de transición A contiene estas probabilidades de transición un_ij entre todos los Estados ocultos. La distribución de estado inicial da las probabilidades de estado específico para el primer punto de tiempo de un seguimiento de tiempo. Usando un enfoque de probabilidad máxima, estos parámetros pueden optimizarse para describir mejor los datos con el adelante-atrás y Baum-Welch algoritmos^20,21. Esto produce los estimadores de máxima verosimilitud (MLE). Por último, se puede inferir la secuencia de estado que es muy probable que la trayectoria de observaciones con el algoritmo de Viterbi. A diferencia de otros análisis HMM de smFRET datos^24,25,26 no utilizamos el HMM como una mera “atenuación” de los datos, pero extracto el modelo cinético de estado del conjunto de datos sin la necesidad para la instalación de tiempo de permanencia histogramas de²⁷. HMM el análisis es hecho con scripts internos con Igor Pro. Aplicación del código se basa en la referencia²¹. Le ofrecemos un kit de software y los datos de ejemplares en nuestra pagina web para seguir las secciones 5 y 6 del presente Protocolo (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). Software completo está disponible bajo petición.

Puntos en los datos con PF de tiempo < -1 o PF > 2 en cualquier canal de detección se asigna la probabilidad de emisión mínima para todos los Estados (10^-200). Esto evita que las transiciones artificiales en estos puntos de datos.

Los parámetros para las probabilidades de emisión se obtienen a partir del ajuste del histograma PF 3D con funciones Gaussian como se describe en el paso 5.7. Estos parámetros se mantienen fijos durante la optimización de lo HMM.

En el enfoque presentado, el vector de distribución del estado inicial y la matriz de transición se utilizan a nivel mundial para describir todo el conjunto de huellas. Que se actualicen en todas las moléculas de N del conjunto de datos según referencia²⁷base.

Parámetros de inicio para la distribución de estado inicial se determinan las proyecciones 2D del histograma PF (paso 5.3) y las probabilidades de transición estén en 0.05 a excepción de las probabilidades de permanecer en el mismo estado, que se eligen tales que la probabilidad de salir de un determinado Estado se normaliza a la unidad.

Un método de generación de perfiles de probabilidad se utiliza para dar intervalos de confianza (IC) para toda transición tarifas^21,22, que sirven como significativas estimaciones de su incertidumbre. Para calcular los límites de la CI para una velocidad específica, la probabilidad de transición de interés se fija en un valor distinto de la EAM. Esto rinde la prueba modelo λ’. Una prueba de la razón (LR) de probabilidad de la probabilidad teniendo en cuenta el conjunto de datos 0 se realiza según:

El 95% de confianza limitado por el parámetro se alcanza cuando LR excede de 3.841, el cuantil del 95% de un x²-distribución con un grado de libertad^22,23.

El poder del método se demuestra con la Hsp90. Esta proteína abundante se encuentra en bacterias y eucariotas y es parte de la respuesta de estrés celular²⁸. Es un blanco de droga prometedor en el tratamiento de cáncer²⁹. Hsp90 es un homodímero con un bolsillo de unión de nucleótido en el dominio N-terminal de cada subunidad³⁰. Pueden experimentar transiciones entre al menos dos conformaciones distintas a nivel mundial, uno cerrado y uno N-terminal conformación abierta en forma de V,^19,31,32. La naturaleza dimérica plantea directamente la cuestión de la interacción entre los dos sitios de unión de nucleótido en Hsp90.

A continuación, proporcionamos un protocolo paso a paso para la adquisición de datos y el análisis de un experimento smFRET tricolor en levadura Hsp90 y nucleótidos. La Unión dependiente de la conformación de la fluorescencia etiquetada AMP-PNP (PNP AMP *, un análogo no hidrolizables de la ATP) se analiza. La aplicación del procedimiento descrito permite el estudio de la Unión de nucleótidos y al mismo tiempo los cambios conformacionales de la Hsp90 y tal modo revela la cooperatividad entre los dos bolsillos de unión de nucleótido de Hsp90.