Usando três cores único-molécula FRET para estudar a correlação de interações da proteína

Muitas proteínas cumprem sua função em dinâmicos complexos com outras moléculas, mediadas por mudanças conformacionais e associações transientes em uma ampla gama de escalas temporais^1,2,3. Acoplado a uma fonte de energia externa (por exemplo, ATP) essas interações dinâmicas podem levar a direcionalidade de um ciclo funcional e, finalmente, manter o estado de desequilíbrio constante em uma célula, o pré-requisito para a vida.

A fim de compreender plenamente essas máquinas moleculares, uma descrição estática guiada por estudos estruturais não é suficiente. Além disso, é essencial ter conhecimento do modelo cinético subjacente e determinar as constantes de velocidade cinética. Vários métodos existentes permitem aos pesquisadores estudar a dinâmica de interações de binárias entre duas moléculas de interesse, por exemplo, ressonância de plasmon de superfície, métodos de relaxamento com uma leitura espectroscópico (por exemplo, o salto ou fluxo parou técnicas) e ressonância magnética nuclear. No entanto, sua aplicabilidade é na maioria dos casos limitados a simples sistemas de dois Estados (por exemplo, um limite e um estado desacoplado) devido a média de inerente às experiências em massa. Em casos onde a mais Estados ou intermediários estão envolvidos, rendem apenas uma mistura complexa das constantes de velocidade. Único-molécula métodos tais como Pinça óptica ou magnética ou smFRET de duas cores, ou seja, um doador e um aceitador fluoróforo, com uma amostra de superfície-imobilizado podem recuperar as constantes de taxa para todos observadas mudanças conformacionais. No entanto, quando se trata de interações que afetam o sítio de ligação a mais de um, esses métodos permanecem limitados e as informações sobre as interações de possível correlação dos dois (ou mais) só será acessíveis via indirectas conclusões de um conjunto de experiências.

Multi cor smFRET^4,5,6,7,8,9 oferece a oportunidade de estudar a interação entre esses componentes directamente, em tempo real e sob condições fisiológicas perto de¹⁰. Isso permite que um para investigar, por exemplo, a vinculação dependente da conformação de um ligante ou outra proteína^8,9,11. A abordagem global apresentada aqui é para rotular as somáticas de interesse em posições específicas, para anexar uma proteína para a superfície da câmara de medição e para controlar a intensidade da fluorescência ao longo do tempo em um prisma-tipo TIRFM (para detalhes veja ^{9 , 12}). a proximidade espacial das tinturas diferentes então pode ser determinada a partir a transferência de energia entre eles. Estratégias de rotulagem pode variar de proteína a proteína (revista em ¹³) e orientações para evitar artefatos nas medições smFRET existem¹⁴.

Desde que um corante doador pode transferir energia para aceitador diferentes corantes em um experimento smFRET multi cor, a posição relativa de todos os corantes não é acessível a partir da excitação de um corante sozinho^15,16. Mas em combinação com a alternância de excitação do laser (ALEX¹⁷e revisto em ¹⁸) este método fornece todas as informações de espaço-temporal em segundo e resolução de sub nanômetros.

No principal, de alta resolução, informações estruturais podem ser conseguidas usando-se as distâncias de tintura inter calculadas a partir da combinação de todas as intensidades de fluorescência em um smFRET de cor multi experiência com ALEX. No entanto, aqui focamos na identificação de estado e de separação, bem como a extração de modelos cinéticos, onde smFRET multi cor é indispensável. Quando “só” determinação de estrutura por triangulação é desejada, um conjunto de experiências mais simples de duas cores smFRET com alta relação sinal-ruído pode ser realizada de^12,19.

Nós usamos a fluorescência parcial () como um proxy para a transferência de energia entre dois fluorophores⁷. A PF é calculado a partir da intensidade de fluorescência análoga à eficiência de traste de um experimento de duas cores:

Onde, é a intensidade de emissão canal em após excitação com cor ex, e c é o aceitador com o comprimento de onda mais longo. Canais de deteção representam a mesma posição na câmara de amostra, mas registros diferentes intervalos espectrais da luz da fluorescência. O mesmo identificador para excitação e emissão são utilizados neste protocolo (ou seja, “azul”, “verde” e “vermelho”).

Por causa de deficiências experimentais as intensidades de fluorescência medido dependem não só sobre a transferência de energia mas também Propriedades fluoróforo e instalação. Para obter a eficiência de transferência de energia verdadeira entre dois fluorophores, as intensidades medidas tem que ser corrigido. O procedimento a seguir baseia-se na referência⁹. Fatores de correção para vazamento aparente (LC, ou seja, a detecção de fótons de um fluoróforo num canal designada para outro corante) e aparente gama (ag, ou seja, o rendimento quântico de fluorescência do corante e a eficiência de deteção do canal) são obtidos a partir de vestígios de único-molécula que mostram um aceitador evento de branqueamento.

O escapamento do doador corante em todos os canais possíveis aceitador é calculado a partir de todos os pontos de dados nos vestígios de fluorescência gravada onde o corante aceitador branqueada, mas o doador é ainda fluorescente ():

A mediana do histograma escapamento é usada como o fator de vazamento aparente. Após a correção para detecção de fugas, o fator gama aparente é determinado a partir do mesmo conjunto de traços. É calculado dividindo-se a mudança da fluorescência no canal aceitador pela mudança de fluorescência no canal ao descoramento do corante aceitador de doador:

Onde c é novamente o canal de deteção para o aceitador com o comprimento de onda mais longo. A mediana da distribuição resultante é usada como o fator de correção aparente.

As intensidades corrigidas em cada canal são obtidas por:

A PF é então calculado de acordo com:

Diferentes populações podem ser separadas no espaço multidimensional ocupado pela s da PF. A posição e a largura de cada Estado é determinado pelo ajuste os dados com funções Gaussian multidimensionais. Otimização subsequente de um HMM global com base em todos os vestígios PF fornece uma descrição quantitativa de cinética observada. Mesmo as pequenas alterações das taxas são detectáveis.

HMMs fornecem uma maneira de se inferir um modelo de estado de uma coleção de traços de tempo barulhento. O sistema é considerado em parte de um conjunto de discreta, Estados ocultos em um determinado momento e a observação real (ou seja, a emissão) é uma função probabilística deste estado oculto²⁰. No caso dos dados de smFRET TIRFM, a emissão probabilidades b_eu por Estado, pode ser modelado por funções de densidade de probabilidade gaussiana contínua. Em pontos regularmente espaçados de tempo discreto, transições de um para outro Estado podem ocorrer de acordo com a probabilidade de transição que é invariante no tempo e só depende do estado atual. A matriz de transição A contém estas probabilidades de transição um_ij entre todos os Estados-Membros escondidos. A distribuição de estado inicial dá as probabilidades específicas de estado para o primeiro ponto de tempo de um rastreamento de tempo. Usando uma abordagem de máxima probabilidade, estes parâmetros podem ser otimizados para melhor descrevem os dados com o para diante-para trás e Baum-Welch algoritmos^20,21. Isso produz os estimadores de máxima verossimilhança (MLE). Finalmente, a sequência de estado que provavelmente produzido a trajetória de observações pode ser inferida com o algoritmo de Viterbi. Em contraste com outras analises HMM smFRET dados^24,25,26 não usamos o HMM como um mero “suavização” da dados, mas o modelo de estado cinético extraído do conjunto de dados sem a necessidade para caber o tempo de permanência histogramas de²⁷. HMM análise é feita com in-house scripts usando Igor Pro. Aplicação do código baseia-se na referência²¹. Nós fornecemos um kit de software e dados exemplares na nossa página da Web para seguir seções 5 e 6 do presente protocolo (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). Software completo está disponível mediante pedido.

Pontos nos dados com PF < -1 ou PF > 2 em qualquer canal de deteção são atribuídos a probabilidade de emissão mínima para todos os Estados (10^-200). Isso impede que transições artificiais nestes pontos de dados.

Os parâmetros para as probabilidades de emissão são obtidos a partir do ajuste do histograma PF 3D com funções Gaussian conforme descrito na etapa 5.7. Esses parâmetros são mantidos fixos durante a otimização do HMM.

Na abordagem apresentada, o vetor de distribuição do estado inicial e a matriz de transição são utilizados mundialmente para descrever todo o conjunto de traços. Eles são atualizados com base em todas as moléculas de N do conjunto de dados de acordo com a referência²⁷.

Parâmetros para a distribuição de estado inicial são determinados de projeções 2D do histograma PF (etapa 5.3) e as probabilidades de transição são definidas como 0,05 com exceção as probabilidades de permanecer no mesmo estado, que são escolhidos tais que a probabilidade de sair de um determinado estado é normalizada à unidade.

Um método de criação de perfil de probabilidade é usado para dar intervalos de confiança (CIs) para todos os transição taxas^21,22, que servem como estimativas significativas para sua incerteza. Para calcular os limites da IC para uma taxa específica, a probabilidade de transição de juros é fixa para um valor diferente do MLE. Isto rende o teste modelo λ’. Um teste de ratio (LR) probabilidade da probabilidade dado o conjunto de dados 0 é realizada de acordo com:

A confiança de 95% vinculada para o parâmetro é alcançado quando LR excede 3,841, o Quantil de 95% de um ^X2-distribuição com um grau de liberdade^22,23.

O poder do método é demonstrado usando o Hsp90. Esta proteína abundante é encontrada em bactérias e eucariotas e é parte do estresse celular resposta²⁸. É um alvo de droga promissora no tratamento de câncer²⁹. Hsp90 é um homodímero com um bolso de ligação de nucleotídeos do domínio N-terminal de cada subunidade³⁰. Ele pode sofrer transições pelo menos duas conformações distintas globalmente, um fechado e um N-terminal conformação aberta, em forma de V^19,31,32. A natureza dimérica diretamente a questão da interação entre os dois locais de ligação de nucleotídeos em Hsp90.

A seguir, fornecemos um protocolo passo a passo para a aquisição de dados e análise de um experimento de smFRET três cores na levedura Hsp90 e nucleotídeos. A vinculação dependente da conformação do AMP-PNP fluorescente etiquetadas (AMP-PNP *, um analog não hidrolisável do ATP) é analisada. A aplicação do procedimento descrito permite o estudo da ligação de nucleótidos e ao mesmo tempo as mudanças conformacionais de Hsp90 e, assim, revela a cooperatividade entre os dois bolsos de vinculação de nucleotídeo de Hsp90.