Bruker tre farger Single-molekylet bånd å studere sammenhengen av Protein interaksjoner

Mange proteiner oppfylle sin funksjon dynamisk komplekser med andre molekyler, formidlet av conformational endringer og forbigående foreninger med et bredt spekter av tidsskalaer^1,2,3. Koblet til en ekstern energikilde (f.eks ATP) disse dynamiske interaksjoner kan føre til retningen i en funksjonell syklus og til slutt opprettholde ikke-likevekt stabil i en celle, en forutsetning for livet.

For å forstå disse molekylær maskiner, er en statisk beskrivelse av strukturelle studier ikke tilstrekkelig. I tillegg er det viktig å ha kjennskap til den underliggende kinetic modellen og å finne kinetic rate konstanter. Mange eksisterende metoder tillate forskere å studere dynamikken i binær interaksjoner mellom to molekyler av interesse, f.eks overflaten plasmon resonans, avslapning metoder med en spektroskopiske avlesning (f.eks hoppe eller stoppet flyt teknikker), og kjernefysiske magnetisk resonans. Men er deres anvendbarhet oftest begrenset til enkle to-stats systemer (f.eks en bundet og en ubundet tilstand) på grunn av den snitt iboende til bulk eksperimenter. I tilfeller der flere stater eller mellomprodukter er involvert, gir de bare en kompleks blanding av hastighet konstanter. Single-molekylet metoder som optisk eller magnetiske pinsett eller to farger smFRET, dvs. en giver og ett acceptor fluorophore, med en overflate-immobilisert prøve kan gjenopprette rate konstanter for alle observerte conformational endringer. Men når det kommer til interaksjoner påvirker flere binding området, disse metodene er fortsatt begrenset og informasjon om mulig sammenheng av to (eller flere) interaksjoner bare være tilgjengelige via indirekte konklusjoner fra et sett av eksperimenter.

Multi-farge smFRET^4,5,6,7,8,9 tilbyr muligheten til å studere samspillet mellom disse komponentene direkte på sanntid og under nær-fysiologiske forhold¹⁰. Dette tillater en å undersøke for eksempel konformasjon-avhengige binding av en ligand eller en annen protein^8,9,11. Den generelle tilnærmingen presenteres her er å merke protein(s) rundt på bestemte stillinger, knytte en protein på overflaten av måling kammeret og spore fluorescens intensiteten over tid på et prisme-type TIRFM (for detaljer se ^{9 , 12}). romlige nærhet til ulike fargestoffer kan deretter bestemmes fra energi-overføring mellom dem. Merking strategier kan variere fra protein protein (omtalt i ¹³) og retningslinjer for å unngå gjenstander i smFRET målinger finnes¹⁴.

Siden en donor fargestoff kan overføre energi til forskjellige acceptor fargestoffer i et multi-farge smFRET eksperiment, er den relative plasseringen av alle fargestoffer ikke tilgjengelig fra magnetisering av ett fargestoff alene^15,16. Men i kombinasjon med vekslende laser eksitasjon (ALEX¹⁷og vurdert i ¹⁸) denne metoden gir alle spatio-temporale informasjon på sub-sekunders og sub nanometer oppløsning.

Rektor, høy oppløsning strukturinformasjon kan oppnås ved hjelp av Inter fargestoff avstander beregnet ut fra kombinasjonen av alle fluorescens bakgrunnsintensitetene i en multi-farge smFRET eksperimentere med ALEX. Men fokusere her vi på staten identifikasjon og separasjon samt utvinning av kinetic modeller, der multi-farge smFRET er uunnværlig. Når “bare” proteinstrukturer ved triangulering er ønsket, kan et sett med enklere to farger smFRET eksperimenter med høy signal-til-støy-forhold være utført^12,19.

Vi bruker den delvis fluorescensen () som en proxy for energi-overføring mellom to fluorophores⁷. PF beregnes fra fluorescens intensiteten tilsvarende bånd effektiviteten av en tofarget eksperiment:

Der er intensiteten i utslipp kanal em etter eksitasjon med farge ex, og c er acceptor med den lengste bølgelengden. Oppdagelsen kanalene representerer samme posisjon i prøven kammer, men posten forskjellige spectral områder fluorescens lyset. Den samme IDen for eksitasjon og utslipp brukes i denne protokollen (dvs. “blue” “grønn” og “rød”).

På grunn av eksperimentelle mangler av målt fluorescens intensiteten ikke bare på energi-overføring, men også på fluorophore og oppsett. For å få den sanne energieffektiviteten for overføring mellom to fluorophores, må de målte intensiteter korrigeres. Følgende er basert på referanse⁹. Korreksjonsfaktorer for tilsynelatende lekkasje (Luk, dvs., gjenkjenning av fotoner fra en fluorophore i en kanal dedikert til et annet fargestoff) og tilsynelatende gamma (ag, dvs. fluorescens quantum avkastningen av fargestoff og effektiviteten deteksjon av kanalen) hentes fra single-molekylet spor som viser en godkjenner bleking hendelsen.

Lekkasje av donor fargestoff i hver mulig acceptor kanalen beregnes fra alle datapunktene i innspilte fluorescens spor hvor acceptor fargestoff bleket men giveren er fortsatt fluorescerende ():

Medianen for lekkasje histogrammet brukes som tilsynelatende lekkasje faktoren. Etter korrigering for lekkasje bestemmes tilsynelatende gamma faktoren fra samme sett med spor. Det beregnes ved endring av fluorescens i acceptor kanalen ved endring av fluorescens i donor kanalen ved bleking acceptor fargestoff:

Hvor c igjen er oppdagelsen kanalen for acceptor med den lengste bølgelengden. Medianen til den endelige fordelingen brukes som tilsynelatende korrigeringsfaktoren.

Korrigert intensiteten i hver enkelt kanal oppnås ved:

PF beregnes slik:

Ulike befolkningsgrupper kan skilles i multi-dimensjonale rommet spredt av PF-s. Posisjonen og bredden av hver stat bestemmes ved å tilpasse dataene med multi-dimensjonale Gaussian funksjoner. Etterfølgende optimalisering av en global HMM basert på alle PF spor gir en kvantitativ beskrivelse av den observerte kinetics. Selv små endringer av prisene er synlig.

HMMs er en måte inferring staten modell fra en samling med støyende tid spor. Systemet anses å være i ett av et sett med diskret, skjulte stater til enhver tid og faktiske observasjon (dvs. utslipp) er en sannsynlig funksjon av dette skjult tilstand²⁰. Ved TIRFM smFRET data, kan de utslipp sannsynligheter b_jeg per stat jeg modelleres ved kontinuerlig Gaussian sannsynlig tetthet funksjoner. På jevnlig spredte diskret tidspunkt, kan overganger fra én til en annen stat oppstå etter overgangen sannsynlighet som hensyn til tid og bare avhengig av gjeldende status. Overgangen matrix A inneholder disse overgang sannsynligheter en_ij mellom alle skjulte. Starttilstand distribusjon gir state-spesifikke sannsynlighetene for første gang punktet av en tid sporing. Med en maksimal sannsynlighet tilnærming, kan disse parametrene optimaliseres best beskriver dataene med forover-bakover og Baum-Welch algoritmer^20,21. Dette gir maksimal sannsynlighet grunnlaget har (MLE). Endelig kan tilstand sekvensen som mest sannsynlig produsert banen observasjoner konkluderes med Viterbi algoritmen. I motsetning til andre HMM analyser av smFRET data^24,25,26 bruker vi ikke HMM som en ren “utjevning” av dataene men utdrag kinetic staten modellen fra datasettet uten behov for å feste holdetiden histogrammer²⁷. HMM analyse er gjort med interne skript ved hjelp av Igor Pro. Implementeringen av koden er basert på referanse²¹. Vi tilbyr en programvare kit og eksemplarisk data på vår for å kunne følge deler 5 og 6 i denne protokollen (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). Full programvare er tilgjengelig på forespørsel.

Tid poeng i dataene med PF < -1 eller PF > 2 i noen oppdagelsen kanalen tilordnes minimale utslipp sannsynligheten for alle stater (10^-200). Dette hindrer kunstig overganger på datapunktene.

Parameterne for utslipp sannsynlighetene er Hentet fra passformen til 3D PF histogrammet Gaussian funksjoner som beskrevet i trinn 5.7. Disse parametrene holdes fast i optimalisering av HMM.

I presentert tilnærming brukes starttilstand distribusjon vektoren og overgangen matrisen globalt å beskrive hele ensemblet i spor. De oppdateres basert på alle N molekyler fra datasettet ifølge referanse²⁷.

Startparametere for starttilstand distribusjon bestemmes fra 2D projeksjoner av PF histogrammet (trinn 5.3) og overgang sannsynlighetene er satt til 0,05 med unntak av sannsynlighetene opphold i denne stat, som er valgt slik at sannsynligheten for å forlate en viss tilstand er normalisert Unity.

Sannsynligheten profilering metode brukes til å gi tillit intervaller (CIs) for alle overgang priser^21,22, som fungerer som meningsfull estimater for deres usikkerhet. Vil beregne grensene for CI for en bestemt hastighet, er overgang sannsynligheten av interesse festet til en annen verdi enn MLE. Dette gir test modell λ’. En sannsynlighet forholdet (LR) test sannsynlighet gitt datasettet 0 er utført i henhold til:

95% tillit bundet for parameteren er nådd når LR overskrider 3.841, 95% quantile av en x²-distribusjon med en grad av frihet^22,23.

Kraften i metoden er demonstrert ved hjelp av Hsp90. Dette rikelig protein i bakterier og eukaryoter og er del av mobilnettet stress respons²⁸. Det er en lovende stoffet mål i kreft behandling²⁹. Hsp90 er en homodimer med en nukleotid binding lomme i N-terminal domene hver delenhet³⁰. Det kan gjennomgå overganger mellom minst to globalt distinkte konformasjonen, en lukket og en N-terminal åpen, V-formet konformasjon^19,31,32. Dimeric natur reiser direkte spørsmål om samspillet mellom de to nukleotid bindende områdene i Hsp90.

Nedenfor gir vi en trinnvis protokoll for datainnsamling og analyse av et tre farger smFRET forsøk på gjær Hsp90 og nukleotid. Konformasjon-avhengige binding av fluorescently merket AMP-PNP (AMP-PNP *, en ikke-hydrolyzable analog ATP) er analysert. Programmet beskrevet prosedyren tillater studie av nukleotid bindingen og samtidig conformational forandringene av Hsp90 og avslører dermed cooperativity mellom to nukleotid bindende lommene på Hsp90.