Usando tre colori singola molecola FRET per studiare la correlazione delle interazioni della proteina

Molte proteine assolvere la loro funzione in dinamici complessi con altre molecole, mediati dai cambiamenti conformazionali e transitorie associazioni su una vasta gamma di scale cronologiche^1,2,3. Accoppiato ad una fonte di energia esterna (ad es., ATP) queste interazioni dinamiche possono portare alla direzionalità in un ciclo funzionale e, infine, mantenere il non-equilibrio stazionario in una cella, il prerequisito per la vita.

Al fine di comprendere appieno queste macchine molecolari, una descrizione statica guidata da studi strutturali non è sufficiente. Inoltre, è essenziale avere conoscenza del modello cinetico e per determinare le costanti cinetiche tasso. Diversi metodi esistenti consentono ai ricercatori di studiare le dinamiche delle interazioni binarie tra due molecole di interesse, ad esempio, la risonanza plasmonica di superficie, metodi di rilassamento con una lettura spettroscopica (ad es., salto o flusso interrotto tecniche) e risonanza magnetica nucleare. Tuttavia, la loro applicabilità è nella maggior parte dei casi limitati a semplici sistemi di due stati (ad esempio, un limite e uno stato non associato) a causa della media inerente agli esperimenti di massa. Nei casi in cui siano coinvolti più Stati o intermedi, cedono solo una miscela complessa delle costanti di tasso. Metodi di singola molecola come pinzette ottiche o magnetiche o due colori smFRET, cioè, un donatore e un fluoroforo accettore, con un campione di superficie-immobilizzata possono recuperare le costanti di velocità per tutti osservati cambiamenti conformazionali. Tuttavia, quando si tratta di interazioni che interessano più di un binding sito, questi metodi rimangono limitati e le informazioni sulle interazioni possibili correlazioni di due (o più) saranno sempre accessibili via indirette conclusioni da una serie di esperimenti.

Multi-colore smFRET^4,5,6,7,8,9 offre l’opportunità di studiare l’interazione tra questi componenti direttamente, in tempo reale e sotto condizioni quasi-fisiologiche¹⁰. Questo permette di indagare, ad esempio, l’associazione dipendente dalla conformazione di un ligando o di un’altra proteina^8,9,11. L’approccio globale presentato qui è per etichettare la proteina di interesse alle posizioni specifiche, per allegare una proteina alla superficie della camera di misura e per monitorare l’intensità di fluorescenza nel tempo su un TIRFM di tipo a prisma (per dettagli Vedi ^{9 , 12}). la prossimità spaziale delle tinture diverse quindi può essere determinata dal trasferimento di energia tra di loro. Strategie di etichettatura può variare da proteina a proteina (rivisto in ¹³) ed esistono linee guida per evitare artefatti nelle misure smFRET¹⁴.

Poiché un colorante donatore può trasferire energia al ricettore diversi coloranti in un esperimento di smFRET multi-colore, la posizione relativa di tutti i coloranti non è accessibile dall’eccitazione di uno tintura solo^15,16. Ma in combinazione con alternanza di eccitazione laser (ALEX¹⁷e ha commentato in ¹⁸) questo metodo fornisce tutte le informazioni spazio-temporali a frazioni di secondo e risoluzione sub-nanometrica.

In linea di principio, ad alta risoluzione informazioni strutturali possono essere ottenute utilizzando le distanze di Inter-tintura calcolato dalla combinazione di tutte le intensità di fluorescenza in un esperimento di smFRET multi-colore con ALEX. Tuttavia, qui ci concentriamo sulla identificazione dello stato e separazione così come l’estrazione di modelli cinetici, dove è indispensabile smFRET multi-colore. Quando “solo” determinazione della struttura di triangolazione è voluta, una serie di esperimenti di smFRET di due colori più semplice con alto rapporto segnale-rumore può essere eseguita^12,19.

Usiamo la fluorescenza parziale () come un proxy per il trasferimento di energia tra due fluorofori⁷. Il PF è calcolato dall’intensità di fluorescenza analoga per l’efficienza FRET di un esperimento di due colori:

Dove, è l’intensità di emissione canale em dopo l’eccitazione con colore ex, e c è il ricettore con la lunghezza d’onda più lunga. Canali di rilevazione rappresentano la stessa posizione nella camera del campione ma registrare diversi campi di spettro della luce di fluorescenza. Lo stesso identificatore per eccitazione e di emissione sono utilizzati nel presente protocollo (cioè, “blu”, “verde” e “rosso”).

A causa delle carenze sperimentali le intensità di fluorescenza misurata dipendono non solo sul trasferimento di energia, ma anche sulle proprietà fluoroforo e installazione. Per ottenere l’efficienza di trasferimento di vera energia tra due fluorofori, le intensità misurate devono essere corretto. La procedura seguente si basa sul riferimento⁹. Fattori di correzione per perdita apparente (LC, vale a dire, la rilevazione di fotoni da un fluoroforo in un canale destinata per un altro colorante) e gamma apparente (ag, vale a dire, il rendimento quantico di fluorescenza del colorante e la efficienza di rivelazione del canale) sono ottenuti da tracce di singola molecola che mostrano un accettore candeggio evento.

La dispersione del colorante donatore in ogni canale possibile acceptor viene calcolata da tutti i punti dati dalle tracce di fluorescenza registrata dove l’accettore sbiancato ma il donatore è ancora fluorescente ():

La mediana dell’istogramma perdita viene utilizzata come il fattore di perdita apparente. Dopo la correzione per la perdita, il fattore gamma apparente è determinato dallo stesso insieme di tracce. Viene calcolato dividendo il cambiamento di fluorescenza nel canale ricettore dal cambiamento di fluorescenza nel canale donatore con lo sbiancamento del colorante accettore:

Dove c è ancora una volta il canale di rilevamento per il ricettore con la lunghezza d’onda più lunga. La mediana della distribuzione risultante viene utilizzata come il fattore di correzione apparente.

La corretta intensità in ciascun canale sono stati ottenuti da:

Il PF è quindi calcolato in base alla:

Diverse popolazioni possono essere separati nello spazio multi-dimensionale, attraversato dal s PF. La posizione e la larghezza di ogni stato è determinata inserendo i dati con funzioni gaussiane multi-dimensionale. Successiva ottimizzazione di uno eh globale basato su tutte le tracce PF fornisce una descrizione quantitativa della cinetica osservata. Anche piccoli cambiamenti delle tariffe sono rilevabili.

HMMs consentono di dedurre un modello di stato da una raccolta di tracce tempo rumoroso. Il sistema è considerato di essere in uno di una serie di discreti, stati nascosti in qualsiasi dato momento e l’effettiva osservazione (cioè, l’emissione) è una funzione probabilistica di questo stato nascosto²⁰. Nel caso di dati di smFRET TIRFM, l’emissione probabilità b_io a stato possono essere modellati da funzioni di densità di probabilità gaussiana continuo. A intervalli di tempo discreti regolarmente spaziati, le transizioni da uno a un altro stato possono verificarsi secondo la probabilità di transizione che è tempo-invariante e dipende solo dallo stato corrente. La matrice di transizione A contiene queste probabilità di transizione un_ij tra tutti gli stati nascosti. La distribuzione di stato iniziale dà le probabilità relative allo stato per il primo punto di tempo di una traccia di tempo. Utilizzando un approccio di massima verosimiglianza, questi parametri possono essere ottimizzati per meglio descrivere i dati con l’avanti-indietro e Baum-Welch algoritmi^20,21. Questo produce gli stimatori di massima verosimiglianza (MLE). Infine, la sequenza di stato che più probabilmente prodotta la traiettoria delle osservazioni può essere dedotta con l’algoritmo di Viterbi. A differenza di altre analisi HMM del smFRET dati^24,25,26 non usiamo il HMM come una mera “smoothing” dei dati ma il modello di stato cinetico l’Estratto dal set di dati senza la necessità per il montaggio di tempo di permanenza istogrammi²⁷. Analisi HMM sono fatto con in-House scripts utilizzando Igor Pro. Implementazione del codice si basa su riferimento²¹. Forniamo un kit di software e dati esemplari sulla nostra pagina Web per seguire le sezioni 5 e 6 del presente protocollo (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). Software completo è disponibile su richiesta.

Tempo punti nei dati con PF < -1 o PF > 2 in qualsiasi canale di rilevamento sono assegnate la probabilità di emissione minima per tutti gli Stati (10^-200). Questo previene le transizioni artificiale in questi punti di dati.

I parametri per la probabilità di emissione sono ottenuti dal fit dell’istogramma 3D PF con funzioni gaussiane come descritto al punto 5.7. Questi parametri sono tenuti fissi durante l’ottimizzazione dell’eh.

Nell’approccio presentato, il vettore di distribuzione stato iniziale e la matrice di transizione vengono utilizzati globalmente per descrivere l’intero ensemble di tracce. Essi vengono aggiornati basato su tutti i N molecole dal set di dati secondo riferimento²⁷.

Parametri di avvio per la distribuzione di stato iniziale sono determinati dalle proiezioni 2D dell’istogramma PF (punto 5.3) e le probabilità di transizione sono riportate a 0,05 fatta eccezione per le probabilità di rimanere nello stesso stato, che sono scelti tali che la probabilità di lasciare un certo stato viene normalizzata all’unità.

Un metodo di analisi di probabilità viene utilizzato per dare gli intervalli di confidenza (CIs) per tutte le transizione tariffe^21,22, che servono come stime significative per loro incertezza. Per calcolare i limiti dell’IC per un tasso specifico, la probabilità di transizione di interesse è fissata su un valore diverso dal MLE. Questo produce la prova modello λ’. Un test di ratio (LR) probabilità del rischio dato il set di dati 0 viene eseguita secondo:

Il 95% di confidenza associato per il parametro è raggiunto quando LR supera 3.841, il quantile 95% di un ^X2-distribuzione con un grado di libertà^22,23.

Il potere del metodo è dimostrato utilizzando la Hsp90. Questa proteina abbondante è trovata nei batteri e negli eucarioti ed è parte della risposta stress cellulare²⁸. È un promettente bersaglio di farmaci nel trattamento di cancro²⁹. Hsp90 è un omodimero con una tasca di legame del nucleotide nel dominio N-terminale di ogni subunità³⁰. Può subire transizioni tra almeno due conformazioni globalmente distinti, uno chiuso e uno N-terminale a forma di V aperta, conformazione^19,31,32. La natura dimerica direttamente solleva il problema dell’interazione tra i due siti di legame del nucleotide in Hsp90.

Di seguito, forniamo un protocollo passo-passo per l’acquisizione dati e l’analisi di un esperimento di tre colori smFRET il lievito Hsp90 e del nucleotide. L’associazione dipendente dalla conformazione di fluorescente contrassegnati AMP-PNP (AMP-PNP *, un analogo non hydrolyzable dell’ATP) viene analizzato. L’applicazione della procedura descritta permette lo studio di associazione del nucleotide e allo stesso tempo i cambiamenti conformazionali di Hsp90 e quindi rivela la cooperatività tra le due tasche di associazione del nucleotide di Hsp90.