Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Markus G&#246;tz; Philipp Wortmann; Sonja Schmid; Thorsten Hugel

doi:10.3791/56896

JoVE Journal > Biochemistry

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생화학

तीन रंग एकल अणु झल्लाहट का उपयोग प्रोटीन बातचीत के सहसंबंध का अध्ययन करने के लिए

Published: January 30, 2018

doi:

10.3791/56896

Markus Götz, Philipp Wortmann, Sonja Schmid², Thorsten Hugel

¹Institute of Physical Chemistry,University of Freiburg, ²Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft,Delft University of Technology

Summary

यहां, हम एक 3 डी पहनावा छिपा मार्कोव मॉडल के साथ तीन रंग smFRET डेटा और उसके विश्लेषण प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस दृष्टिकोण के साथ, वैज्ञानिकों जटिल प्रोटीन सिस्टम से काइनेटिक जानकारी cooperativity या संबद्ध बातचीत सहित, निकाल सकते हैं ।

Abstract

एकल अणु Förster अनुनाद ऊर्जा अंतरण (smFRET) एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है के लिए गैर-अणुओं की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए भौतिक तकनीक है । एक कोशिका प्रोटीन में कई आणविक मशीनों के लिए अपने कार्य को पूरा करने के लिए एक कार्यात्मक चक्र में बातचीत भागीदारों के साथ मिलकर कार्य करने के लिए है । दो रंग बहु रंग smFRET के विस्तार के लिए यह एक साथ एक से अधिक बातचीत या गठन परिवर्तन से जांच संभव बनाता है । यह न केवल smFRET प्रयोगों के लिए एक नया आयाम जोड़ता है, लेकिन यह भी सीधे घटनाओं के अनुक्रम का अध्ययन करने के लिए और एक मैटीरियल नमूना और एक कुल आंतरिक प्रतिबिंब का उपयोग करते समय संबंधित बातचीत का पता लगाने के लिए अद्वितीय संभावना प्रदान करता है प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (TIRFM). इसलिए, बहु रंग smFRET एक मात्रात्मक तरीके से और एक पहले से ही प्राप्त विस्तार में गैर आणविक परिसरों का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी उपकरण है ।

यहां, हम प्रदर्शन प्रोटीन पर बहु रंग smFRET प्रयोगों की विशेष चुनौतियों को दूर करने के लिए कैसे. हम डेटा प्राप्त करने के लिए और काइनेटिक जानकारी निकालने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । यह पता लगाने के चयन मानदंड, राज्य जुदाई, और एक 3 डी पहनावा छिपा मार्कोव मॉडल (हंम) का उपयोग कर शोर डेटा से राज्य पथ की वसूली शामिल हैं । अंय तरीकों की तुलना में, काइनेटिक जानकारी आवास समय हिस्टोग्राम लेकिन सीधे हम्म से बरामद नहीं है । अधिकतम संभावना फ्रेमवर्क हमें गंभीर काइनेटिक मॉडल का मूल्यांकन करने के लिए और दरों के लिए सार्थक अनिश्चितताओं प्रदान करने के लिए अनुमति देता है ।

गर्मी सदमे प्रोटीन ९० (Hsp90) के लिए हमारे विधि लागू करके, हम न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी और प्रोटीन के वैश्विक गठन परिवर्तन को फंसाए रखने में सक्षम हैं । यह हम सीधे Hsp90 डिमर के दो न्यूक्लियोटाइड बंधन जेब के बीच cooperativity का निरीक्षण करने के लिए अनुमति देता है ।

Introduction

कई प्रोटीन्स अन्य अणुओं के साथ गतिशील परिसरों में अपने कार्य को पूरा करते हैं, timescales¹^,²^,³की एक विस्तृत श्रृंखला पर संरचना परिवर्तन और परिवर्तनीय संघों द्वारा मध्यस्थता । एक बाहरी ऊर्जा स्रोत (जैसे, एटीपी) के लिए युग्मित इन गतिशील बातचीत एक कार्यात्मक चक्र में दिशात्मकता के लिए नेतृत्व और अंततः एक कोशिका में गैर संतुलन स्थिर-राज्य बनाए रखने के लिए, जीवन के लिए शर्त कर सकते हैं ।

आदेश में पूरी तरह से इन आणविक मशीनों को समझने के लिए, एक स्थिर संरचनात्मक अध्ययन द्वारा निर्देशित विवरण पर्याप्त नहीं है । इसके अलावा, यह अंतर्निहित काइनेटिक मॉडल का ज्ञान है और काइनेटिक दर स्थिरांक निर्धारित करने के लिए आवश्यक है । कई मौजूदा तरीकों शोधकर्ताओं के हित के दो अणुओं के बीच द्विआधारी बातचीत की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए अनुमति देते हैं, जैसे, सतह plasmon अनुनाद, एक स्पेक्ट्रोस्कोपी readout के साथ छूट तरीकों (जैसे, कूद या बंद कर दिया-प्रवाह तकनीक), और परमाणु चुंबकीय अनुनाद । हालांकि, उनकी प्रयोज्यता ज्यादातर मामलों में साधारण दो राज्य प्रणालियों तक सीमित है (जैसे, एक ही और एक असीम राज्य) औसत थोक प्रयोगों के लिए निहित के कारण । मामलों में जहां अधिक राज्यों या मध्यवर्ती शामिल हैं, वे दर स्थिरांक का केवल एक जटिल मिश्रण उपज । एकल-अणु विधियों जैसे ऑप्टिकल या चुंबकीय चिमटी या दो रंग smFRET, यानी, एक दाता और एक स्वीकारकर्ता fluorophore, एक सतह के साथ एक मैटीरियल नमूना सभी स्वीकार्य परिवर्तन के लिए दर स्थिरांकों को पुनर्प्राप्त कर सकते हैं । हालांकि, जब यह एक से अधिक बाध्यकारी साइट को प्रभावित करने के लिए बातचीत की बात आती है, इन तरीकों सीमित रहने और दो (या अधिक) बातचीत केवल प्रयोगों का एक सेट से अप्रत्यक्ष निष्कर्ष के माध्यम से सुलभ हो जाएगा के संभावित सहसंबंध पर जानकारी ।

बहु रंग smFRET⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹ के लिए इन घटकों के बीच बातचीत का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है सीधे, वास्तविक समय में और के तहत निकट शारीरिक शर्तों¹⁰। यह एक उदाहरण के लिए जांच करने के लिए अनुमति देता है, एक ligand या किसी अंय प्रोटीन की रचना-निर्भर बाध्यकारी⁸^,⁹^,¹¹। समग्र दृष्टिकोण यहां प्रस्तुत करने के लिए विशिष्ट पदों पर ब्याज की प्रोटीन (ओं) लेबल है, माप चैंबर की सतह के लिए एक प्रोटीन संलग्न करने के लिए, और एक चश्मे पर समय के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता ट्रैक-प्रकार TIRFM (विवरण के लिए ⁹ देखें ^, ¹²). विभिंन रंगों की स्थानिक निकटता तो उन दोनों के बीच ऊर्जा हस्तांतरण से निर्धारित किया जा सकता है । लेबलिंग रणनीतियों प्रोटीन से प्रोटीन के लिए भिन्न हो सकते हैं ( ¹³में समीक्षा की) और दिशा निर्देशों smFRET माप में कलाकृतियों से बचने के लिए¹⁴मौजूद.

के बाद से एक दाता डाई एक बहु रंग smFRET प्रयोग में अलग स्वीकार करने के लिए ऊर्जा हस्तांतरण कर सकते हैं, सभी रंगों के सापेक्ष स्थिति एक अकेले डाई के उत्तेजना से नहीं पहुंच रहा है¹⁵^,¹⁶। लेकिन बारी लेजर उत्तेजना (एलेक्स¹⁷के साथ संयोजन में, और ¹⁸में समीक्षा की) इस विधि सब spatio-दूसरा और उप नैनोमीटर संकल्प में लौकिक जानकारी प्रदान करता है ।

प्रिंसिपल में, उच्च संकल्प संरचनात्मक जानकारी एक बहु-रंग एलेक्स के साथ smFRET प्रयोग में सभी प्रतिदीप्ति तीव्रता के संयोजन से गणना अंतर डाई दूरी का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है । हालांकि, यहां हम राज्य की पहचान और जुदाई के रूप में के रूप में अच्छी तरह से काइनेटिक मॉडल, जहां बहु रंग smFRET अपरिहार्य है की निकासी पर ध्यान केंद्रित । जब “केवल” triangulation द्वारा संरचना दृढ़ संकल्प वांछित है, उच्च सिग्नल के लिए शोर अनुपात के साथ सरल दो रंग smFRET प्रयोगों का एक सेट¹²^,¹⁹प्रदर्शन किया जा सकता है ।

हम दो fluorophores⁷के बीच ऊर्जा हस्तांतरण के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में आंशिक प्रतिदीप्ति () का उपयोग करें । पीएफ एक दो रंग प्रयोग की झल्लाहट दक्षता के अनुरूप प्रतिदीप्ति तीव्रता से गणना की है:

जहां, उंहें रंग पूर्वके साथ उत्तेजना के बाद उत्सर्जन चैनल में तीव्रता है, और सी सबसे लंबी तरंग दैर्ध्य के साथ स्वीकारकर्ता है । पता लगाने चैनल नमूना कक्ष में एक ही स्थिति का प्रतिनिधित्व करते हैं, लेकिन प्रतिदीप्ति प्रकाश के विभिन्न वर्णक्रम पर्वतमाला रिकॉर्ड. उत्तेजना और उत्सर्जन के लिए एक ही पहचानकर्ता इस प्रोटोकॉल (यानी, “नीला,” “हरे,” और “लाल”) में उपयोग किया जाता है ।

क्योंकि प्रयोगात्मक कमियों मापा प्रतिदीप्ति तीव्रता न केवल ऊर्जा हस्तांतरण पर लेकिन यह भी fluorophore और सेटअप संपत्तियों पर निर्भर करते हैं । आदेश में दो fluorophores के बीच सच ऊर्जा हस्तांतरण दक्षता प्राप्त करने के लिए, मापा तीव्रता को सही किया जाना है । निंन कार्यविधि संदर्भ⁹पर आधारित है । स्पष्ट रिसाव के लिए सुधार कारकों (लालकृष्ण, यानी, एक और डाई के लिए नामित चैनल में एक fluorophore से फोटॉनों का पता लगाने) और स्पष्ट गामा (एजी, यानी, डाई की प्रतिदीप्ति क्वांटम उपज और चैनल का पता लगाने की क्षमता) एकल अणु निशान है कि एक स्वीकार्य ब्लीचिंग घटना दिखाने से प्राप्त कर रहे हैं ।

हर संभव स्वीकारकर्ता चैनल में दाता डाई के रिसाव दर्ज प्रतिदीप्ति निशान में सभी डेटा बिंदुओं से गणना की है, जहां स्वीकार करने वाले डाई प्रक्षालित लेकिन दाता अभी भी फ्लोरोसेंट है ():

रिसाव हिस्टोग्राम का औसत स्पष्ट रिसाव कारक के रूप में प्रयोग किया जाता है । रिसाव के लिए सुधार के बाद, स्पष्ट गामा कारक निशान के एक ही सेट से निर्धारित होता है । इसे स्वीकारर चैनल में प्रतिदीप्ति के परिवर्तन को दाता चैनल में प्रतिदीप्ति के परिवर्तन द्वारा विभाजित द्वारा गणना की है स्वीकारकर्ता डाई के ब्लीचिंग पर:

जहां c फिर से स्वीकारकर्ता के लिए सबसे लंबी तरंग दैर्ध्य के साथ खोज चैनल है । परिणामी वितरण का माध्य स्पष्ट सुधार कारक के रूप में उपयोग किया जाता है ।

प्रत्येक चैनल में सही तीव्रता द्वारा प्राप्त कर रहे हैं:

इसके अनुसार पीएफ की गणना तब की जाती है:

विभिन्न आबादियों को पीएफएस के द्वारा फैले बहु-आयामी अंतरिक्ष में अलग किया जा सकता है । स्थिति और प्रत्येक राज्य की चौड़ाई बहु आयामी गाऊसी कार्यों के साथ डेटा फिटिंग द्वारा निर्धारित होता है । एक वैश्विक सभी पीएफ निशान के आधार पर हम्म के बाद अनुकूलन मनाया कैनेटीक्स का एक मात्रात्मक विवरण प्रदान करता है । दरों में भी छोटे बदलाव का पता लगा रहे हैं ।

HMMs शोर समय निशान का एक संग्रह से एक राज्य मॉडल को उपलब्ध कराने का एक तरीका प्रदान करते हैं । प्रणाली को किसी भी समय और वास्तविक प्रेक्षण (यानी, उत्सर्जन) इस हिडन राज्य²⁰के एक संभाव्य समारोह है पर असतत, छिपा राज्यों का एक सेट में से एक में माना जाता है । TIRFM smFRET डेटा के मामले में, उत्सर्जन संभावनाओं बी_मैं राज्य के प्रति मैं सतत गाऊसी संभावना घनत्व कार्यों द्वारा मॉडलिंग की जा सकती है । नियमित रूप से स्थान पर असतत समय अंक, एक से दूसरे राज्य में संक्रमण संक्रमण संभावना है कि समय-अपरिवर्तनीय है और केवल वर्तमान स्थिति पर निर्भर करता है के अनुसार हो सकता है । संक्रमण मैट्रिक्स एक इन संक्रमण संभावनाओं सभी छिपा राज्यों के बीच एक_ij शामिल हैं । प्रारंभिक स्थिति वितरण एक समय ट्रेस के पहली बार बिंदु के लिए राज्य-विशिष्ट संभावनाओं देता है । एक अधिकतम संभावना दृष्टिकोण का उपयोग करना, इन मापदंडों को सबसे अच्छा आगे-पिछड़े और Baum-वेल्च एल्गोरिदम²⁰^,²¹के साथ डेटा का वर्णन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । यह अधिकतम संभावना अनुमान (MLE) पैदावार । अंतत:, Viterbi एल्गोरिथ्म के साथ अवलोकन की गति का उत्पादन किया है जो स्थिति अनुक्रम अनुमानित कर सकते हैं । smFRET डेटा²⁴^,²⁵^,²⁶ के अंय हंम विश्लेषण के विपरीत में हम हंम डेटा का एक मात्र “चिकनी” के रूप में उपयोग नहीं करते हैं, लेकिन फिटिंग के लिए समय की आवश्यकता के बिना सेट डेटा से काइनेटिक राज्य मॉडल निकालें ²⁷हिस्टोग्राम । हंम विश्लेषण के साथ किया जाता है घर में लिपियों इगोर समर्थक का उपयोग कर । कोड का कार्यांवयन संदर्भ²¹पर आधारित है । हम इस प्रोटोकॉल (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret) के वर्गों 5 और 6 का पालन करने के क्रम में हमारे वेबपेज पर एक सॉफ्टवेयर किट और अनुकरणीय डेटा प्रदान करते हैं । पूर्ण सॉफ्टवेयर अनुरोध पर उपलब्ध है ।

किसी भी डिटेक्शन चैनल में पीएफ <-1 या pf > 2 के साथ डेटा में समय बिंदुओं को सभी राज्यों (10^-२००) के लिए ंयूनतम उत्सर्जन संभाव्यता असाइन की जाती है । यह इन डेटा बिंदुओं पर कृत्रिम संक्रमण को रोकता है ।

उत्सर्जन संभावनाओं के लिए पैरामीटर्स 3d पीएफ हिस्टोग्राम के फ़िट से प्राप्त किए जाते है जैसा कि चरण ५.७ में वर्णित गाऊसी फ़ंक्शन के साथ होता है । इन मापदंडों हम्म के अनुकूलन के दौरान तय रखा जाता है ।

प्रस्तुत दृष्टिकोण में, प्रारंभिक राज्य वितरण वेक्टर और संक्रमण मैट्रिक्स दुनिया भर में उपयोग किया जाता है निशान के पूरे पहनावा वर्णन । वे संदर्भ के अनुसार²⁷डेटा सेट से सभी N अणुओं के आधार पर अद्यतन किया जाता है ।

प्रारंभिक स्थिति वितरण के लिए पैरामीटर्स प्रारंभ करें पीएफ हिस्टोग्राम (चरण ५.३) के 2d अनुमानों से निर्धारित होते है और संक्रमण संभावनाओं को ०.०५ पर उसी अवस्था में रहने के लिए संभावनाओं के अपवाद के साथ सेट किया जाता है, जिसे ऐसे चुना जाता है कि एक निश्चित राज्य छोड़ने की संभावना एकता को सामान्यीकृत है ।

एक संभावना profiling विधि सभी संक्रमण दर²¹^,²²है, जो अपने अनिश्चितता के लिए सार्थक अनुमान के रूप में सेवा के लिए विश्वास अंतराल (सीआईएस) देने के लिए प्रयोग किया जाता है । एक विशिष्ट दर के लिए CI की सीमा की गणना करने के लिए, ब्याज की संक्रमण प्रायिकता MLE के अलावा किसी अन्य मान के लिए ठीक किया गया है । इस पैदावार को टेस्ट मॉडल λ ‘. डेटा सेट 0 दिए जाने की संभावना का एक संभावना अनुपात (LR) परीक्षण के अनुसार किया जाता है:

९५% पैरामीटर के लिए बाध्य विश्वास तक पहुंच जाता है जब LR ३.८४१ से अधिक है, ९५% quantile एक x²-वितरण की स्वतंत्रता²²^,²³के एक डिग्री के साथ ।

विधि की शक्ति Hsp90 का उपयोग कर प्रदर्शित किया जाता है । यह प्रचुर मात्रा में प्रोटीन बैक्टीरिया और eukaryotes में पाया जाता है और सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया²⁸का हिस्सा है । यह एक आशाजनक दवा है कैंसर के इलाज में लक्ष्य²⁹। Hsp90 प्रत्येक उपइकाई³⁰के एन टर्मिनल डोमेन में एक न्यूक्लियोटाइड बंधन जेब के साथ एक homodimer है । यह संक्रमण के बीच कम से दो वैश्विक रूप से अलग अनुरूपता, एक बंद कर सकते है और एक N-टर्मिनल खुला, वी के आकार के अनुरूप¹⁹^,³¹^,^३२। dimeric प्रकृति सीधे Hsp90 में दो न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग साइटों के बीच एक नाटक का सवाल उठाती है ।

निंन में, हम डेटा प्राप्ति और तीन-रंग smFRET प्रयोग के खमीर Hsp90 और न्यूक्लियोटाइड पर विश्लेषण के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । अनुरूप-फ्लोरोसेंट लेबल amp-pnp (amp-pnp *, एक गैर एटीपी के अनुरूप hydrolyzable) का विरूपण पर निर्भर बाध्यकारी विश्लेषण किया है । वर्णित प्रक्रिया के आवेदन न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी का अध्ययन परमिट और एक ही समय में Hsp90 के गठन के परिवर्तन और इस तरह Hsp90 के दो न्यूक्लियोटाइड बंधन जेब के बीच cooperativity पता चलता है ।

Protocol

1. सेटअप और आवश्यकताएँ एक चश्मे पर बहु रंग smFRET माप-प्रकार TIRFM प्रदर्शन करते हैं । जौव प्रकाशन के रूप में दो-रंग सेटअप का वर्णन संदर्भ12में दिया गया है । एक बहु रंग TIRFM का निर्माण । एक सामांय लेआउ…

Representative Results

बहु रंग smFRET माप दो या अधिक अलग संपर्क साइटों के बीच सहसंबंध का प्रत्यक्ष पता लगाने की अनुमति देते हैं । यह बहु-घटक सिस्टम, जैसे प्रोटीन परिसरों की जांच करने के लिए अद्वितीय तकनीक रेंडर करता ह?…

Discussion

हम एक जटिल प्रोटीन प्रणाली और इन माप के विश्लेषण का एक कदम दर कदम विवरण के लिए तीन रंग smFRET डेटा प्राप्त करने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं । इस दृष्टिकोण के लिए अद्वितीय संभावना को सीधे …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

यह काम जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (39/969-1) और यूरोपीय अनुसंधान परिषद द्वारा वित्त पोषित है ईआरसी अनुदान समझौते n. ६८१८९१ के माध्यम से ।

Materials

Setup
vibration-damped optical table	Newport, Irvine, CA, USA	RS2000
OBIS 473nm LX 75mW LASER	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1185052
OBIS 532nm LS 50mW LASER	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1261779
OBIS 594nm LS 60mW LASER	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1233470
OBIS 637nm LX 140mW LASER	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1196625
laser control unit	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1234465	Scientific Remote
aspheric telescope lenses	Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA		d=25.4mm, f=50mm and f=100mm
CF ex1	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZET 473/10	cleanup filter excitation
CF ex2	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZET 532/10	cleanup filter excitation
CF ex3	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZET 594/10	cleanup filter excitation
CF ex4	Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA	FL635-10	cleanup filter excitation
DM ex1	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZQ594RDC	dichroic mirror excitation
DM ex2	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	570DCXR	dichroic mirror excitation
DM ex3	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZQ491RDC	dichroic mirror excitation
AOTFnC-Vis	AA Opto-Electronic, Orsay, France
λ/4 plate	Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA	AQWP05M-600
CFI Apo TIRF 100x	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA		high-NA objective
piezo focus positioner MIPOS 250 CAP	piezosystem jena GmbH, Jena, Germany		Piezo Controller NV 40/1 CLE
piezo stepper	Newport, Irvine, CA, USA	PZA12	PZC200-KT NanoPZ Actuator Kit
achromatic aspheric lenses	Qioptiq Photonics GmbH & Co. KG, Göttingen, Germany	G322-304-000	d=50mm, f=200mm
adjustable optical slit	Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany	27.160.1212	max. aperture 12 x 12 mm
DM det1	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	T 600 LPXR	dichroic mirror detection
DM det2	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	H 560 LPXR superflat	dichroic mirror detection
DM det3	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	HC BS R635	dichroic mirror detection
BP det1	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	525/40 BrightLine HC	bandpass filter detection
BP det2	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	586/20 BrightLine HC	bandpass filter detection
BP det3	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	631/36 BrightLine HC	bandpass filter detection
BP det4	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	700/75 ET Bandpass	bandpass filter detection
optical shutters detection	Vincent Associates, Rochester, NY, USA	Uniblitz VS25S2T0
EMCCD iXon Ultra 897	Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland
digital I/O card, PCIe-6535	National Instruments, Austin, Texas, USA
syringe pump	Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA	PHD22/2000
Name	Company	Catalog Number	Comments
Flow chamber
quartz slides	G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA		Spectrosil2000, h=3mm
TEGADERM film	3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany	1626W	10 x 12cm
spray adhesive	3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany	Photo Mount 050777
glycerol	Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany	Immersol G
immersion oil	OLYMPUS EUROPA SE & CO. KG, Hamburg, Germany	IMMOIL-F30CC
prism	Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Germany		Suprasil1
aluminium prism holder			custom built
hollow setscrews	Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA		with custom drilling
Tygon S3 E-3603 tubing	neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	2-4450	ACF00001
PTFE tubing	Bohlender GmbH, Grünsfeld, Germany	S1810-08
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sample
yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin			UniProt ID P02829
Maleimide derivatives of Atto488, Atto550	ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany
AMP-PNP*	Jena Bioscience, Jena, Germany		γ-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N
Fluospheres	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	F8764	amine-modified, 0.2 μm, yellow-green fluorescent
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Andor Solis	Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland		version 4.30
LabVIEW	National Instruments, Austin, Texas, USA		version 2012, 32bit; misc. hardware control
MDS control software	AA Opto-Electronic, Orsay, France		version 2.03a
Coherent Connection	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA		version 3
Igor Pro	WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA		version 6.37

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Götz, M., Wortmann, P., Schmid, S., Hugel, T. Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions. J. Vis. Exp. (131), e56896, doi:10.3791/56896 (2018).