À l’aide de trois couleurs frette de molécules simples pour étudier la corrélation des Interactions de protéine

Beaucoup de protéines remplissent leur fonction dans les dynamiques complexes avec d’autres molécules, médiées par des changements de conformation et associations transitoires sur une large gamme d’échelles de temps^1,2,3. Couplé à une source d’énergie externe (p. ex., ATP) ces interactions dynamiques peuvent conduire à la directionnalité dans un cycle fonctionnel et en fin de compte maintenir l’état d’équilibre hors de l’équilibre dans une cellule, la condition sine qua non pour la vie.

Pour bien comprendre ces machines moléculaires, une description statique, guidée par des études structurales n’est pas suffisante. En outre, il est essentiel d’avoir une connaissance du modèle cinétique sous-jacent et de déterminer les constantes cinétiques. Plusieurs méthodes existantes aux chercheurs d’étudier la dynamique des interactions binaires entre deux molécules d’intérêt, par exemple, la résonance plasmonique de surface, des méthodes de relaxation avec une lecture spectroscopique (p. ex., saut ou arrêt d’écoulement techniques) et la résonance magnétique nucléaire. Cependant, leur applicabilité est le plus souvent limitée à des systèmes simples de deux États (par exemple, une liaison et un État indépendant) en raison de l’étalement inhérente à l’expérimentation en vrac. Dans le cas où plusieurs États ou intermédiaires sont impliqués, ils donnent seulement un mélange complexe des constantes de vitesse. Méthodes de molécules simples tels que des pinces optiques ou magnétiques ou deux couleurs smFRET, c.-à-d. un donneur et un accepteur fluorophore, auprès d’un échantillon de surface immobilisée peuvent récupérer les constantes de vitesse pour tous observé des changements de conformation. Cependant, quand il s’agit d’interactions qui touchent plus d’un accepteur, ces méthodes restent limitées et les informations sur les interactions de la corrélation possible entre les deux (ou plus) ne seront accessibles par l’intermédiaire de conclusions indirectes d’un ensemble d’expériences.

Multi-color smFRET^4,5,6,7,8,9 offre la possibilité d’étudier l’interaction entre ces éléments directement, en temps réel et sous des conditions physiologiques près de¹⁰. Cela permet d’étudier par exemple, la liaison de conformation dépendant d’un ligand ou d’une autre protéine^8,9,11. L’approche générale présentée ici est d’étiqueter les protéines d’intérêt aux positions spécifiques, d’attacher une protéine à la surface de la chambre de mesure et de suivre l’intensité de la fluorescence au fil du temps sur un TIRFM type de prisme (pour détails voir ^{9 , 12}). la proximité spatiale des différents colorants peut décider du transfert d’énergie entre eux. Stratégies d’étiquetage peut varier de protéine à la protéine (évaluée à ¹³) et il existait des directives pour éviter les artefacts dans les mesures smFRET¹⁴.

Puisqu’un colorant donneur peut transférer l’énergie aux colorants différents accepteurs dans une expérience multi-color smFRET, la position relative de tous les colorants n’est pas accessible depuis l’excitation d’un colorant seul^15,16. Mais en combinaison avec une alternance d’excitation de laser (ALEX¹⁷et examiné dans ¹⁸), cette méthode fournit toutes les informations spatio-temporelles à la seconde et résolution sous nanomètre.

En principe, haute résolution informations structurelles peuvent être réalisées en utilisant les distances inter-colorants calculée à partir de la combinaison de toutes les intensités de fluorescence dans une expérience multi-color smFRET avec ALEX. Cependant, ici, nous nous concentrons sur l’identification de l’État et de séparation, mais aussi l’extraction des modèles cinétiques, où smFRET multicolore est indispensable. Lorsque vous souhaitez « seulement » détermination de structure par triangulation, une série d’expériences de deux couleurs smFRET plus simples avec rapport signal-bruit élevé peut être effectué^12,19.

Nous utilisons la fluorescence partielle () comme un proxy pour le transfert d’énergie entre deux fluorophores⁷. Le PF est calculée à partir de l’intensité de fluorescence analogue à l’efficacité FRET d’une expérience de deux couleurs :

Où, est l’intensité d’émission canal em après excitation avec couleur ex, et c est l’accepteur avec la longueur d’onde plus longue. Canaux de détection représente la même position dans le compartiment de mesure mais enregistrer différentes gammes spectrales de la lumière de fluorescence. Le même identificateur pour l’excitation et d’émission sont utilisés dans le présent protocole (c’est-à-dire, « bleu », « vert » et « rouge »).

En raison de lacunes expérimentales, les intensités de fluorescence mesurée dépendent non seulement sur le transfert d’énergie, mais aussi sur les propriétés de configuration / fluorophore. Afin d’obtenir l’efficacité de transfert d’énergie véritable entre deux fluorophores, les intensités mesurées doivent être corrigées. La procédure suivante repose sur la référence⁹. Facteurs de correction pour la fuite apparente (lk, c’est-à-dire, la détection de photons d’un fluorophore dans un canal nommée pour un autre colorant) et gamma apparent (ag, c.-à-d. le rendement quantique de fluorescence du colorant et la efficacité de la détection du chenal) sont obtenus à partir des traces de molécules simples qui montrent un accepteur d’événement de blanchiment.

La fuite du colorant donneur dans tous les canaux possibles accepteur est calculée à partir de tous les points de données dans les traces de fluorescence enregistré où le colorant accepteur blanchi, mais le donateur est toujours fluorescent () :

La médiane de l’histogramme de fuite est utilisée comme le facteur de fuite apparente. Après correction des fuites, le facteur gamma apparent est déterminé de la même série de traces. Il est calculé en divisant le changement de la fluorescence dans le canal de l’accepteur par le changement de fluorescence dans le chenal de donneur sur le blanchiment de la teinture de l’accepteur :

Où c est encore une fois le canal de détection pour l’accepteur avec la longueur d’onde plus longue. La médiane de la distribution qui en résulte est utilisée comme le facteur de correction apparente.

Les intensités corrigées dans chaque canal sont obtenues par :

Le PF est ensuite calculé selon :

Des populations différentes peuvent être séparées dans l’espace multidimensionnel, enjambé par le s PF. La position et la largeur de chaque État est déterminé en ajustant les données avec des fonctions gaussiennes multidimensionnelles. Optimisation ultérieure d’un HMM global basé sur toutes les traces PF fournit une description quantitative de la cinétique observée. Même les petits changements des tarifs sont détectables.

HMMs permettent de déduire un modèle d’état d’une collection de tracés chronologiques bruyant. Le système est considéré comme en partie d’une série de discret, États cachés à un moment donné et l’observation réelle (c’est-à-dire l’émission) est une fonction probabiliste de cet état masqué²⁰. Dans le cas des données TIRFM de smFRET, l’émission probabilités b_je par état j’ai peuvent être modélisés par des fonctions de densité de probabilité gaussienne continue. Aux points régulièrement espacés de temps discret, transitions à partir d’un autre État peuvent se produire selon la probabilité de transition qui est invariant et dépend seulement de l’état actuel. La matrice de transition A contient ces probabilités de transition un_ij entre tous les États cachés. La répartition de l’état initial donne les probabilités de spécifiques à l’état pour le premier point de temps d’une trace du temps. En utilisant une approche du maximum de vraisemblance, ces paramètres peuvent être optimisés pour décrire au mieux les données avec l’avant-arrière et algorithmes de Baum-Welch^20,21. Cela donne les estimateurs du maximum de vraisemblance (MLE). Enfin, la séquence de l’État qui a probablement produit la trajectoire des observations peut être déduite avec l’algorithme de Viterbi. Contrairement à d’autres analyses HMM des smFRET données^24,25,26 , nous n’utilisons pas le HMM comme un simple « lissage » des données, mais le modèle cinétique état extrait le jeu de données sans avoir besoin pour ajuster les temps de pause histogrammes²⁷. HMM analyse se fait avec les scripts internes à l’aide de Igor Pro. Mise en œuvre du code repose sur²¹de référence. Nous fournissons un kit logiciel et données exemplaires sur notre site Web afin de suivre les sections 5 et 6 du présent protocole (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). Logiciel complet est disponible sur demande.

Fois points dans les données avec PF < -1 ou PF > 2 dans n’importe quel canal de détection sont assignés à la probabilité d’émission minimal pour tous les États (10^-200). Vous éviterez les transitions artificielles à ces points de données.

Les paramètres pour les probabilités des émissions proviennent de l’ajustement de l’histogramme 3D de PF avec fonctions gaussiennes comme indiqué au point 5.7. Ces paramètres sont maintenus fixes durant l’optimisation de la HMM.

Dans l’approche présentée, le vecteur de distribution état initial et la matrice de transition sont utilisés dans le monde pour décrire l’ensemble entier de traces. Elles sont mises à jour basées sur toutes les molécules de N de l’ensemble des données selon la référence²⁷.

Les paramètres de démarrage pour la distribution de l’état initial sont déterminés à partir des projections 2D de l’histogramme PF (étape 5.3) et les probabilités de transition sont définies à 0,05 à l’exception des probabilités de rester dans le même État, qui sont choisis de telle que la probabilité de quitter un certain état est normalisée à l’unité.

Une méthode de profilage de probabilité est utilisée pour donner des intervalles de confiance (IC) pour toute transition taux^21,22, qui servent des estimations significatives pour leur incertitude. Pour calculer les limites de la CI pour un taux spécifique, la probabilité de transition d’intérêt est fixée à une valeur autre que le MLE. Cela donne le test modèle λ’. Un test du rapport (LR) de probabilité du risque compte tenu de l’ensemble de données 0 est effectuée conformément à :

La confiance de 95 % liée pour le paramètre est atteinte lorsque LR dépasse 3.841, la quantile de 95 % d’un x²-distribution avec un seul degré de liberté^22,23.

La puissance de la méthode est démontrée à l’aide de la Hsp90. Cette protéine abondante se trouve chez les bactéries et des eucaryotes et fait partie de la réponse de stress cellulaire²⁸. C’est une cible de médicament prometteur dans le traitement de cancer du²⁹. HSP90 est un homodimère avec une poche de liaison de nucléotides dans le domaine N-terminal de chaque sous-unité³⁰. Il peut subir une transition entre au moins deux conformations globalement distinctes, l’un fermé et un N-terminal conformation ouverte en forme de V,^19,31,32. La nature dimère pose directement la question de l’interaction entre les deux sites de liaison de nucléotides dans Hsp90.

Par la suite, nous fournissons un protocole étape par étape d’acquisition de données et d’analyse d’une expérience de trois couleurs smFRET sur levure Hsp90 et nucléotides. La liaison de conformation dépendant du fluorescent étiqueté AMP-PNP (AMP-PNP *, un analogue non hydrolysable de l’ATP) est analysé. L’application de la procédure décrite permet l’étude de la liaison de nucléotides et en même temps les changements de conformation de la Hsp90 et révèle ainsi la coopération entre les deux poches de liaison de nucléotides de Hsp90.