JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
환경과학

Sur le site Molecular Detection of phytopathogènes transmises par le sol à l’aide d’un système PCR en temps réel Portable

Published: February 23, 2018
doi:
10.3791/56891
, , , , , ,
1Department of Plant Pathology,Washington State University, 2Parma Research and Extension Center,University of Idaho

Summary

Détection rapide et précise des agents pathogènes sur place, en particulier terricole phytopathogènes, est cruciale pour prévenir d’autres production d’inoculum et la prolifération des maladies des plantes sur le terrain. La méthode développée ici en utilisant un système de détection de PCR en temps réel portable permet un diagnostic sur place dans des conditions réelles.

Abstract

Diagnostic sur place des maladies des plantes peut être un outil utile pour les cultivateurs pour les décisions en temps opportun, ce qui permet la mise en oeuvre plus tôt des stratégies de gestion des maladies qui réduisent l’impact de la maladie. Actuellement de nombreux laboratoires de diagnostics, la réaction en chaîne par polymérase (PCR), notamment Real-time PCR, est considérée comme la méthode la plus sensible et précise pour la détection des pathogènes végétaux. PCRs en laboratoire nécessitent toutefois, matériel de laboratoire coûteux et un personnel qualifié. Dans cette étude, les pathogènes transmis par le sol de pomme de terre servent à démontrer le potentiel de détection moléculaire sur place. Ceci a été réalisé en utilisant un protocole simple et rapid composée d’extraction magnétique axée sur la perle des acides nucléiques, PCR en temps réel portable (fluorogénique par sonde assay). L’approche PCR en temps réel portable comparé favorablement à une détection en laboratoire de système, aussi peu que 100 exemplaires de l’ADN de Spongospora subterranea. La méthode PCR en temps réel portable développée ici peut servir d’alternative aux approches axées sur les laboratoires et sur le site utile pour le diagnostic de l’agent pathogène.

Introduction

Identification précise et rapide des agents pathogènes causatifs impact significativement décisions concernant la gestion des maladies végétales. Les maladies transmises par le sol sont particulièrement difficiles à diagnostiquer car l’environnement du sol est extrêmement volumineux par rapport aux plantes massives et complexes, ce qui en fait un défi de comprendre tous les aspects des maladies transmises par le sol. En outre, les maladies transmises par le sol peuvent être asymptomatique durant les premiers stades de l’infection, dépendent de facteurs de stress environnementaux, et certains ont de longues périodes de latence qui donnent lieu à des diagnostics retardés1. De nombreux pathogènes transmis par le sol ont développé des structures de survie, tels que les spores spécialisés ou des hyphes mélanisée qui peuvent survivre dans le sol pendant de nombreuses années, même en l’absence de leurs hôtes. Les approches utilisées pour la gestion des maladies transmises par le sol comprennent : éviter les champs infestés connus, à l’aide de semis et les semences certifiées exempts de micro-organismes pathogènes, gardant les équipements sanitaires et à restreindre les mouvements des sols et des eaux lorsque cela est possible. Connaissance de la présence d’agents pathogènes grâce à des stratégies de détection moléculaire peut également jouer un rôle utile en informant des décisions en temps opportun concernant les traitements préliminaires ou planter des quotes-parts des champs. Essai sur place offre des avantages supplémentaires de fournir un résultat rapid sans envoyer l’échantillon à un laboratoire de diagnostic que peut-être quelque distance away et aussi peut se livrer au producteur si un tel diagnostic est effectué « champ côté » en leur présence.

Pour un diagnostic sur place basé sur la détection moléculaire, sensibilité, spécificité, robustesse (répétabilité et reproductibilité) et efficacité (i.e., simplicité et coût de performance) sont des facteurs cruciaux aux fins d’examen. Latérale dispositifs d’écoulement (DFLs) tels que les Immunostrip et les PocketDiagnostic, sont des méthodes populaires pour la détection des pathogènes sur place en raison de leur simplicité comme un test en une seule étape. Cependant, DFLs ne peut-être pas l’outil de diagnostic droit dans toutes les situations parce qu’ils n’ont pas la sensibilité et la spécificité et fournit parfois des résultats ambigus si l’agent pathogène cible est en faibles concentrations et peut de réaction croisée avec les même espèces ou genres 2. amplification isotherme boucle-négociée (lampe) est également applicable pour la détection des pathogènes sur place et est particulièrement bon marchée en raison de la faible coût réactifs, conditions de la réaction qui restent constantes et simple analyse colorimétrique de visual. Cependant, fois DFLs et feu servent généralement d’un point de vue qualitatif, même si les deux approches peuvent être utilisées quantitativement avec l’équipement plus cher3. La réaction en chaîne par polymérase (PCR) offre grande spécificité, sensibilité élevée et une capacité quantitative en comparaison avec les méthodes susmentionnées de détection. Cependant, la technologie PCR conventionnelle en laboratoire nécessite l’équipement de laboratoire coûteux et un personnel qualifié, qui est un inconvénient majeur dans l’adoption de cette technologie comme une méthode de détection pour l’application sur place.

Dans ce protocole, une méthode de diagnostic sur place à l’aide d’un appareil de PCR en temps réel portable est démontrée. La technologie PCR en temps réel offre des avantages par rapport aux autres méthodes en termes de précision quantitative, la sensibilité et la polyvalence et a été largement utilisée pour la détection d’un large éventail de plantes pathogènes4,5, y compris divers pathogènes de pomme de terre au sol6. En raison des tendances récentes du marché concurrentiel en pleine expansion, équipement requis pour la technologie PCR a continué à développer pour être plus compact et moins cher7. Le protocole se compose des étapes suivantes : extraction magnétique axée sur la perle des acides nucléiques, PCR en temps réel portable (fluorogène basée sur l’analyse dosage) et analyse des données quantitatives qui peut tout faire à distance en utilisant un ordinateur portable (Figure 1).

En utilisant le protocole PCR portable développé ici, des échantillons de sol ont été analysés pour détecter l’agent pathogène terricole, Spongospora subterranea. Spongospora a été choisi car c’est un agent pathogène important de pommes de terre comme agent causal de la gale poudreuse8. Ces dernières décennies, la présence de cette maladie est considérée a répandue dans de nombreuses régions où les pommes de terre sont cultivées9,10. Gale poudreuse, grâce à la présence de bouton comme des lésions sur les tubercules peuvent provoquer des pertes de rendement qualitatif considérable aux cultivateurs de pommes de terre. En outre, S. subterranea peut vecteur du Mop Top Virus (PMTV), qui peuvent provoquer des symptômes de lésion interne en tubercules (appelées taches en couronne)11,12. Par conséquent, il est important de savoir si S. subterranea est présent dans les champs avant la plantation6. Nous démontrons également l’utilité du présent protocole pour la détection de Rhizoctonia solani anastomose groupe 3 (AG3) et Rattle. Bien que plusieurs groupes d’anastomose de Rhizoctonia solani provoquent des maladies chez les pommes de terre, AG3 est sans doute la plus importante dans le monde entier13, causant le chancre de la tige et le rhizoctone entraînant des pertes de rendement commercialisable jusqu’à 30 %14. Rattle provoque des lésions nécrotiques dans les tubercules, qui sont communément appelés taches en couronne. Ce virus a été signalé récemment pour la première fois dans plusieurs États dans le Pacifique Nord-Ouest15,16,17et est une préoccupation croissante aux producteurs dans cette région de plus en plus important de pommes de terre. En plus de déterminer l’efficacité de PCR portable pour ces maladies importantes, optimale DNA extraction méthodologie et sol taille de l’échantillon ont aussi été examinées dans cette étude.

Les résultats suggèrent que la méthode PCR portable est polyvalent et applicable pour la détection de pathogènes différents. La méthode de détection sur place, que nous avons développé permet aux travailleurs de première ligne dans le secteur agricole (p. ex., producteurs) de prendre des décisions antérieures concernant la gestion des maladies, telles que des sélections de variété ou de rotations et permet de quantifier un phytopathogène dans l’échantillon au cours d’une enquête de terrain, avant la plantation, pour éviter d’éventuelles épidémies.

Protocol

1. sur le site détection moléculaire de pathogènes à l’aide d’un système de PCR en temps réel Portable Remarque : Voir la Figure 1. Extraction d’ADN axée sur les perles magnétiqueRemarque : Un magnétique basé sur perle ADN kit d’extraction (par exemple de Primerdesign) a été utilisé selon les instructions du fabricant. Tous les réactifs doivent être conservés à température ambiante (18-25 ° C). Une fois que le lyophilisé protéinase K (flacon n ° 1) est suspendue (à l’aide de bouteille No.1a), conserver à-20 ° C. Mélanger 20 à 50 mg d’échantillon de sol avec 500 µL de Solution de préparation d’échantillon dans un microtube.Remarque : Le rapport de sol : préparation Solution est important comme les mélangeant à d’autres ratios peuvent provoquer une défaillance d’expériences en aval (par exemple, la contamination par les inhibiteurs de PCR). Broyer la terre sur le fond du tube à l’aide d’un petit Pilon stérile jusqu’à ce que la solution est trouble. Outre suspendre les particules du sol dans la solution en secouant le microtube et laissez-le reposer, non perturbée, de laisser le sol particules se déposent complètement (généralement entre 5 à 10 min). Transférer 200 µL de liquide surnageant dans un microtube frais et ajouter 200 µL de tampon de lyse (flacon n ° 2 : solution de chlorhydrate de Guanidine) et 20 µL de protéinase K (flacon n ° 1). Bien mélanger le lysat en renversant le tube et laisser incuber à température ambiante pendant 15 minutes.Remarque : Si le lysat se trouve sur le couvercle du microtube, appuyez sur le tube ou utilisez une centrifugeuse, le cas échéant de retirer le couvercle. Ajouter 500 µL de la mélange de billes magnétique/tampon de liaison (flacon n ° 3) pour l’échantillon lysé. Bien mélanger en pipetage de haut en bas et incuber à température ambiante pendant 5 mn le portoir magnétique.Remarque : Prenez soin de mélanger la solution de perle bien avant utilisation pour que les perles soient aliquotés uniformément de la bouteille de stockage. Placer le microtube sur le portoir magnétique. Attendre au moins 2 min ou jusqu’à ce que toutes les perles dans le microtube de fixer au mur côté magnétique. Ensuite, retirer et jeter tous le surnageant de pipetage.Remarque : Ne pas déranger les billes aimantés tout en enlevant et en aspirant le liquide surnageant. L’ADN a maintenant été capturée par les billes magnétiques. Enlevez le microtube le portoir magnétique, ajouter 500 µL de tampon de lavage-1 (bouteille n ° 4 : solution d’éthanol/perchlorate de sodium) et remettre en suspension les perles de pipetage répétées jusqu’à ce que les perles sont uniformément dispersées. Effectuez cette étape de lavage pour éliminer les protéines et sel de l’échantillon. Laissez le mélange reposer pendant 30 s. Répétez l’étape 1.1.6. Enlevez le microtube le portoir magnétique, ajouter 500 µL de tampon de lavage-2 (flacon n ° 5 : solution d’éthanol/perchlorate de sodium) et remettre en suspension les perles de pipetage répétées jusqu’à ce que les perles sont uniformément dispersées. Laissez le mélange reposer pendant 30 s. Répétez l’étape 1.1.6. Retirez le microtube le portoir magnétique et puis ajouter 500 µL d’éthanol à 80 % (flacon n ° 6).Remarque : Cette étape est nécessaire pour l’élimination des sels résiduels de l’échantillon. Remettre en suspension les perles de pipetage répétées jusqu’à ce que les perles sont uniformément dispersées. Laissez cette position pendant 10 min avec le mélange occasionnels par inversion. Répétez l’étape 1.1.6. Sécher à l’air le culot de billes magnétiques pendant 10 min à température ambiante avec le microtube couvercle ouvert.Remarque : Les perles doivent être exemptes de toute éthanol résiduel visible mais pas complètement asséchée. Retirez le microtube le portoir magnétique, ajouter 50-200 µL de tampon d’élution (flacon n ° 7) et remettre en suspension les perles de pipetage répétées jusqu’à ce que les perles sont uniformément dispersées et laissez reposer pendant 30 s.Remarque : Dans les étapes ci-dessus, l’ADN purifié est libéré des billes magnétiques dans le tampon d’élution. Placer le microtube sur le portoir magnétique. Attendre au moins 2 min ou jusqu’à ce que toutes les perles dans le microtube de fixer au mur côté magnétique. Transférer le surnageant qui contient maintenant l’ADN/ARN purifié à un microtube 0,5 mL pour une utilisation dans les opérations en aval. PCR en temps réel portableRemarque : Un thermocycleur portable et le kit de test PCR ont été utilisés selon les instructions du fabricant (voir la Table des matières). Ouvrez et exécutez le logiciel thermocycleur-associés, sélectionnez le test de détection de cible et toutes les informations de description dans les champs de saisie de données nom & des détails, des Notes, des échantillons et les Tests d’entrée.Remarque : Puits #1 et #2 sont désignés par le logiciel pour le contrôle négatif et un témoin positif, respectivement. Préparer le PCR réactifs avant toute utilisation. Transférer 500 µL du mélange principal tampon remise en suspension dans le mélange maître lyophilisés contenant de tube et mélanger bien par inversion. Transférer le mélange maître ensemble dans microtube marron étiqueté amorces/sonde (tableau 2). Boucher et agiter le microtube de mélanger. Mélange intime est nécessaire pour s’assurer que tous les composants sont remis en suspension complètement. Laisser ce mélange reposer 5 min avant utilisation.Remarque : Conservez le mélange réactionnel à-20 ° C après utilisation. Préparer un contrôle négatif en transvasant 10 µL du mélange préparé de réaction de l’étape précédente dans un tube PCR de 0,2 mL et ajouter 10 µL d’eau déionisée stérile exempte de nucléase. Préparer un témoin positif en transférant 10 µL du mélange préparé de réaction de l’étape 1.2.2 dans un tube PCR de 0,2 mL et ajouter 10 µL de modèle de contrôle positif. Pour chaque échantillon, transférer 10 µL du mélange préparé de réaction de l’étape précédente dans un tube PCR de 0,2 mL et puis ajouter 10 µL de l’échantillon ADN préparé à partir d’étape 1.1.16. Charger les puits du thermocycleur avec le contenu de leurs tubes respectifs de la PCR comme indiqué au point 2.1.1. Une fois toutes les informations nécessaires a été entrées et confirmées, sélectionnez Démarrer Exécuter et choisir l’instrument connecté à ethernet ou une clé USB.Remarque : Si le lecteur USB est sélectionnée, le fichier à exécuter doit être sauvegardé sur le disque pour être utilisé avec le thermocycleur (p. ex., F:\genesig). La course commencera immédiatement après que le disque est inséré dans le thermocycleur. Analyse des données de la PCR en temps réel portable. Une fois la course terminée, ouvrez le fichier à exécuter (.usb) depuis la clé USB en utilisant le logiciel associé thermocycleur ou regarder directement les résultats d’exécution dans le logiciel en cliquant sur les résultats. Avant d’analyser les résultats, enregistrez la course terminée pour éviter de perdre des données. Dans l’onglet résultats , consulter l’état de la piste, classés par échantillons.Remarque : Données qui peuvent être obtenues dans cet onglet sont l’état des résultats et copiez le numéro détectée dans l’échantillon. Cliquez sur l’onglet Détails pour afficher les courbes de l’amplification. Lorsque la cible est détectée avec succès, les valeurs de Cq (cycle de quantification) de la cible et le contrôle interne sont affichées.Remarque : Ces valeurs sont calculées dans le rapport final et servent à déterminer si un échantillon est positif pour la cible et si il y a des problèmes avec la réaction ou les échantillons d’ADN. 2. les autres protocoles Autres méthodes d’extraction ADN en laboratoire Méthodes basées sur le CTAB-phénol-chloroforme Exécuter des méthodes de CTAB-phénol-chloroforme fondé, suivant la méthode de Doyle18 et la méthode de Dellaporta19 comme décrit plus haut. Méthode de mini-préparation ADNRemarque : La méthode de Edwards20 s’est déroulée comme suit. Ajoutez 500 mg de sol, suivi de cinq perles en céramique de 1,4 mm et 750 µL de tampon de Edwards (200 mM Tris, pH 8,0, 200 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5 % SDS) à un microtube et mélangez bien. Incuber le microtube à 65 ° C pendant 5 min. Homogénéiser l’échantillon avec un homogénéisateur de batteur de perle pour 60 s (ou en utilisant un mortier et un pilon). Centrifuger l’échantillon à 14 000 x g pendant 5 min. Transférer 500 µL de surnageant dans un microtube frais, puis mélanger avec 500 µL d’isopropanol réfrigéré. Mélanger en retournant le tube 10 fois. Centrifuger l’échantillon à 14 000 x g pendant 15 min Pelletiser l’ADN. Éliminer le surnageant et laissez l’air de pellet ADN sécher à température ambiante jusqu’à ce que l’éthanol restant se soit évaporée. Laver le culot d’ADN avec 750 µL d’éthanol à 70 % réfrigérés. Sécher à l’air la pastille avant de re-suspendre dans 50-100 µL de tampon TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 et 1 mM EDTA). Autres méthodes alternatives Effectuer l’extraction de l’ADN de silice-base à l’aide de la trousse #1 (MP BIO vitesse ADN tourner) et kit #2 (Zymo BIOMICS DNA Miniprep Kit) selon les instructions du fabricant. PCR en temps réel en laboratoire classique.Remarque : Un thermocycleur classique a été utilisé avec mastermix pour PCR basée sur sonde, divers apprêts et sondes oligonucléotidiques (tableau 2). À l’aide de la PCR à fond opaque tubes ou une plaque PCR, préparer 20 réactions µL pour tous les échantillons d’ADN à analyser, ainsi qu’un négatif de contrôle (eau déminéralisée exempte de nucléase) et un contrôle de modèle positif préparé interne. Des tubes de chaque PCR ou bien, préparer un mélange comprenant 10 µL de la mastermix, 7 µL d’eau désionisée exempte de nucléase, 2 µL de 2 µM amorces/sonde et 1 µL de l’échantillon d’ADN (de l’étape 1.1.16 ou 2.1) ou modèle de contrôle, par exemple. Fermer les tubes PCR ou la plaque et de commencer la réaction en sélectionnant le programme approprié de la PCR. Analyse de PCR en temps réel en laboratoire classique Logiciels associés à thermocycleur permet d’analyser les résultats du thermocycleur classique. Pour commencer l’analyse des données, transférez le fichier exécuter le thermocycleur sur une clé USB, insérez une clé USB et sélectionnez Exporter. Ouvrir le fichier de données (.pcrd) de l’exporté exécuter dans le logiciel associé thermocycleur. Mettez en surbrillance le puits d’un échantillon de localiser son correspondant bien sur l’instrument. Courbes d’amplification et des courbes standard (le cas échéant) sont générés automatiquement. Si les informations de l’échantillon ne sont pas entrées, cliquez sur Configuration de plaque ou une fonction similaire pour commencer la saisie des données avant d’analyser les données. Afficher les données sous l’onglet de quantification ; Cela peut être exportée pour analyse de données avec un logiciel de tiers tels que lecteurs de fichier CSV, XML ou HTML. Obtenir des données de Cq basées sur des seuils déterminés et comparez-le avec les contrôles positifs et négatifs.Remarque : Si les normes de l’ADN de la cible ont été utilisés dans le test, comparer les données à celle des normes pour déterminer le seuil de Cq Cq

Representative Results

Comparaison des méthodes d’extraction de l’ADN La compatibilité d’une méthode d’extraction ADN magnétique axée sur le talon avec la PCR en temps réel a été évaluée en détectant la quantité d’ADN de S. subterranea dans un échantillon de sol provenant de champs infestés par l’agent pathogène. Comme le montre la Figure 1, la méthode axée sur les perles magnétique a été comparée avec les autres méthodes, y compris un CTAB-phénol-chloroforme selon méthode18, rapide ADN mini préparation méthodes19,20et autres standards kits d’extraction d’ADN à base de silice. Des échantillons d’ADN extraites à l’aide de différentes méthodes de six ont été soumis à la PCR en temps réel en laboratoire classique. Les résultats suggèrent que la méthode axée sur les billes magnétique est comparable avec les autres méthodes, bien que le kit d’extraction d’ADN à base de silice a montré les meilleures performances parmi les méthodes que nous avons testé. Tous les kits contiennent le thiocyanate de guanidinium ou chlorhydrate de guanidine : tous deux sont des agents chaotropiques puissant qui dénaturent la plupart des protéines cellulaires, y compris les RNases et DNase. Par conséquent, en utilisant les méthodes est adapté pour les extractions d’ADN et d’ARN. Comparaison entre une PCR en temps réel portable et une PCR en temps réel classique en laboratoire Pour comparer la sensibilité et la spécificité d’une PCR portable à une PCR classique en laboratoire, la quantification absolue de l’agent pathogène, que l’ADN a été effectuée à l’aide de quantités différentes du gène ITS S. subterranea , qui a été réalisée par le vecteur pGEM-T21 . Une série de dilutions 10 fois du gène ITS (106 100 exemplaires) ont été analysés en utilisant les amorces/sonde de SsTQ set22. Les résultats ont démontré que la méthode PCR portable détecté le pathogène cible ADN (~ 100 exemplaires), bien que la sensibilité était 10 fois moins que que de la méthode PCR conventionnelle en laboratoire, qui a détecté au moins 10 exemplaires (Figure 2). Pour plus de validation, sols artificiellement infestées ont été testés. S. subterranea sporosores proviennent des Galles de racine de gale poudreuse de racines de pommes de terre. Les sols ont été infestés avec des suspensions sporosores à une concentration finale de 105 sporosores/g de poids sec du sol. À l’aide de la méthode axée sur les billes magnétique, ADN a été extrait à partir des échantillons de sol infesté, et 10 fois des dilutions successives ont été préparées afin d’obtenir des concentrations équivalentes à 105, 104, 103, 102, 101et 100 sporosores/g de matière sèche du sol. Les échantillons d’ADN ont été utilisés pour PCR en utilisant le SPO apprêt/sonde set23. Les résultats ont montré que la méthode PCR portable a une capacité analytique comparable à une méthode PCR conventionnelle en laboratoire mais, encore une fois, la sensibilité a été réduite par un facteur d’environ 10 (Figure 3). Enfin, nous avons testé un échantillon de sol d’un champ qui a été naturellement contaminé par S. subterranea. L’extraction d’ADN axée sur les perles magnétique a été réalisée sur des quantités différentes de sols (10, 20, 50 et 100 mg de sol par 500 µL de solution de tampon d’extraction). Les résultats suggèrent que le poids optimal du sol comme matière première pour l’extraction de l’ADN a été de 50-100 mg (Figure 4). Quantités de sol en dehors de la plage a entraîné une défaillance des mesures PCR en aval. Cet effet pourrait être parce que lorsque des quantités excessives de sol sont utilisées comme matériau de départ, des contaminations (p. ex., des composés phénoliques) peuvent interférer avec la PCR24. Dans le cas de la baisse des volumes de sol, la quantité d’extrait d’ADN peut être inférieure à la limite de détection de la PCR (p. ex., le rendement de l’ADN extrait du sol de 10-20 mg a été variée au total). Sensibilité a été tout à fait comparable entre la PCR portable et les méthodes conventionnelles de PCR. Des résultats similaires ont été obtenus dans des échantillons d’ADN de différentes méthodes d’extraction (la Figure 2) Détection d’autres pathogènes par le système de détection sur place à l’aide d’une PCR en temps réel portable Nous avons testé la méthode PCR portable pour détecter les autres pathogènes importants terricole de pommes de terre, r. solani AG3 et Rattle. Dans cette étude, nous avons réalisé une PCR en temps réel à l’aide de l’ ensemble sonde amorces/RQP1 RsTq25 r. solani AG3 détection avec l’ADN de culture pure. Nous avons également effectué PCR en temps réel en utilisant le Rattle-D apprêt/sonde set26 pour la détection de Rattle avec de l’ARN d’un échantillon de tuber symptomatique des taches en couronne a été utilisé. Comme illustré à la Figure 5, la méthode PCR portable détecté avec succès les deux pathogènes. Les résultats étaient comparables entre les instruments portatifs et classiques, ce qui suggère que la méthode PCR portable est versatile et applicables aux autres détections pathogène si les séquences d’amorces conçues pour PCR en temps réel sont disponibles. La figure 1. Procédure d’un système portable de PCR en temps réel pour la détection des pathogènes sur place. Le protocole est composé d’étapes dans l’ordre suivant : préparation lysate par homogénéisation bref (A), extraction magnétique axée sur la perle des acides nucléiques (B), la PCR en temps réel portable (C) et analyse de données quantitatives à l’aide d’un ordinateur portable (D). Notez que toutes les étapes peuvent être complétées sur le site. Figure 2 . Comparaison de la sensibilité entre un portable PCR et une PCR classique en laboratoire. Quantification de l’ADN du pathogène ont été effectuée avec des quantités différentes du gène ITS S. subterranea (106 100 exemplaires) avec l’amorces/sonde SsTQ défini. Régression linéaire entre la valeur du journal de l’ADN de plasmide S. subterranea et de la valeur de Log réciproque de Cq sur le thermocycleur classique (A) et le thermocycleur portable (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 . Comparaison des performances de détection dans les sols infestés artificiellement avec S. subterranea. Les sols ont été artificiellement infestés (105 à 100 sporosores/g de matière sèche du sol) avec S. subterranea sporosores suspensions. À l’aide de la méthode axée sur les billes magnétique, l’ADN a été extrait des échantillons de sol infesté. PCR ont été effectuées en utilisant les échantillons de sol avec le jeu d’apprêt/sonde de SPO. Régression linéaire entre la valeur de log de la quantité de départ en sporosores par gramme de sol et la valeur de Cq log réciproque sur le thermocycleur classique (A) et le thermocycleur portable (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 . Comparaison de la quantité d’échantillons de sol pour l’extraction d’ADN de départ. La méthode axée sur les perles magnétique a été utilisée pour l’extraction d’ADN de 10, 20, 50 et 100 mg d’échantillons de sol. PCR en temps réel ont été effectuées à l’aide du thermocycleur portable. Les courbes standards représentent la relation entre la quantité d’ADN total extrait des échantillons de sol (axe x) et les quantités de produit de PCR (axe y) amplifiées par le jeu d’apprêt/sonde de Sss. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 5 . Détection d’autres pathogènes de la pomme de terre, r. solani et Rattle. PCR en temps réel ont été effectués avec le thermocycleur portable et le thermocycleur classique. R. solani AG3 était détecté dans l’ADN total extrait de culture pure à l’aide d’amorces RsTq et la RQP1 sonde que PMTV (A) a été détectée dans l’ARN total extraite d’un échantillon de tubercules infectés par Rattle à l’aide que la Rattle-D apprêt/sonde la valeur (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 6 . Un pipeline de diagnostic pour phytopathogènes. Organigramme présente un déroulement général de diagnostic phytopathogène. Veuillez noter que l’étape traditionnelle, par exemple, l’identification visuelle, peut être omise si la détection moléculaire sur place est utilisée, ce qui rend tout le processus de diagnostic simple et rapide. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. PCR en temps réel portable PCR en temps réel LAMPE ELISA Latérale-flux Coût par réaction de la cible 0,60 $-$8,47 0,60 $ 0,75 $ 0,60 $ 4,74 $ Sensibilité 100 exemplaires 10 exemplaires 10 exemplaires 1-10 sporosores331-10 ng/mL (protéine)33 1-10 sporosores345 x 105UFC/mL35 Temps frais 90 minutes 80 à 240 minutes 50-90 minutes32 3-24 heures 10-15 minutes Préparation requise ●Nucleic extraction acideAmorces ● ●Nucleic extraction acideConception de Primer/sonde ● Extraction acide de Nucelic ●Amorces ● Extraction de protéine ●● les anticorps N/A Autres matériaux requis ● Portable thermocycleur ● thermocycleur classique Tache de colorimétriques ●● Incubateur Lecteur de plaques ●● des équipements de lavage N/A Le tableau 1. Tableau comparatif des méthodes de détection moléculaires et sérologiques de phytopathogènes Apprêt Séquence (5′ – 3′)un Objectifb SsTQ-F13 CCGGCAGACCCAAAACC ITS1-ITS2 dans subterranea S. SsTQ-R13 CGGGCGTCACCCTTCA ITS1-ITS2 dans subterranea S. SsTQ-P13 [FAM] CAGACAATCGCACCCAGGTTCTCATG [TAM] ITS1-ITS2 dans subterranea S. Genesig S.subterranea apprêt/sonde N/A Actine dans subterranea S. SPO1014 GGTCGGTCCATGGCTTGA ITS dans subterranea S. SPO1114 GGCACGCCAATGGTTAGAGA ITS dans subterranea S. SPOPRO114 [FAM] CCGGTGCGCGTCTCTGGCTT [TAM] ITS dans subterranea S. RsTqF119 AAGAGTTTGGTTGTAGCTGGTCTATTT ITS1-ITS2 dans r. solani RsTqR119 AATTCCCCAACTGTCTCACAAGTT ITS1-ITS2 dans r. solani RQP119 [FAM] TTTAGGCATGTGCACACCTCCCTCTTTC [TAM] ITS1-ITS2 dans r. solani Genesig PMTV apprêt/sonde N/A CP-RT dans Rattle Rattle-D-F20 AGAATTGRCATCGAAACAGCA CP à Rattle Rattle-D-R20 GTCGCGCTCCAATTTCGTT CP à Rattle Rattle-D-P20 [FAM] CCACAAACAGACAGGTATGGTCCGGAA [TAM] CP à Rattle un Amorces oligo ADN ont été modifiés avec FAM (6-carboxyfluorescéine) ou TAM (5-carboxytetramethylrhodamine) b ITS : Espaceurs internes transcrits, CP : manteau de protéine ; CP-RT : manteau indissoluble de la protéine Le tableau 2. Amorces utilisées dans cette étude Supplémentaire Figure 1. Comparaison entre les méthodes d’extraction de l’ADN pour la détection de l’agent pathogène gale poudreuse. Six différentes méthodes d’extraction de l’ADN (A-F) ont été comparés pour la détection de l’agent pathogène gale poudreuse, S. subterranea dans des échantillons de sol. (B, D, F). L’ADN a été extraite à l’aide de kit à base de silice #1 à base de silice (voir la Table des matières pour tous les noms de kit), kit #2 et magnétique kit axée sur le talon, repsectively. PCR a été réalisée à l’aide du thermocycleur PCR conventionnels en laboratoire. Les courbes standards représentent la relation entre la quantité d’ADN totale extraite les échantillons de sol et les quantités de produit de PCR amplifiés par le jeu d’amorces/sonde SsTQ. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre. Supplémentaires Figure 2. Comparaison de la limite de détection entre un portable PCR et une PCR classique en laboratoire. L’ADN total a été isolé dans un échantillon de sol à l’aide de trois différentes méthodes d’extraction : (A, méthode B) Doyle, (C, D) à base de silice ensemble #2 et (E, F) le kit de base perle magnétique. Graphes indiqués sur la gauche sont données à l’aide du thermocycleur portable avec le jeu d’amorces/sonde de Sss, tandis que les graphiques à droite représentent les données générées à l’aide du thermocycleur classique en laboratoire avec l’amorces/sonde SsTQ défini. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

Discussion

Comme indiqué dans le tableau 1, à l’identification moléculaire des agents pathogènes, les progrès technologiques récents ont augmenté l’efficacité, précision et vitesse de diagnostic, qui ont contribué à la détection des infections présymptomatiques27. Portant sur le diagnostic sur place, lampe et méthodes flux latéral sont fréquemment utilisés parce qu’ils sont portables et fournissent des résultats immédiats à moindre coût. Toutefois, dans le cas des méthodes sérologiques, détection spécifique à l’espèce peut être difficile à atteindre. Cela provoque parfois mauvaise détection des microbes hors cible comme les communs habitants de sol. Par exemple, il peut y avoir une réaction croisée entre les tests sérologiques de Phytophthora spp. et Pythium spp. dans le cas de la pomme de terre pathogènes28, ce qui indique qu’il y a parfois des difficultés à détecter l’usine ciblée agents pathogènes.

Dans la présente étude, nous avons développé un protocole optimisé pour la détection moléculaire sur place des pathogènes telluriques de pommes de terre à l’aide de l’ordinateur portable de la PCR en temps réel en comparant ses capacités avec celle d’un système temps réel PCR classique en laboratoire. Nous avons trouvé que la méthode sur le site détecte précisément les pathogènes de la pomme de terre dans l’échantillon de sol, même si la sensibilité est environ 10 fois inférieure à celle d’un test en laboratoire équivalent. Il est également à considérer que dans ce cas, test du laboratoire et de terrain n’a pas utilisé un échantillon biologiquement pertinente. Vastes échantillons sont nécessaires pour une utilisation lors de dépistage régulièrement sols comme décrit précédemment29,30, où la taille des échantillons d’entre 250 g et 1 kg est traitée, bien que ces méthodes exigent des opérateurs qualifiés et sophistiqué équipement pour extraire l’ADN. En général, un sol à grande échelle des extraits d’ADN provient d’un échantillon représentatif de sol global unique de plusieurs sous-échantillons au-dessus de 1 à 4 hectares6,29,30. Toutefois, le protocole développé ici est rapide, facile à utiliser pour les utilisateurs n’ayant aucune expérience préalable dans le diagnostic moléculaire et peut être utilisé en dehors d’un laboratoire. Car la méthode est rapide et relativement bon marché par rapport à l’extraction du sol à grande échelle, il pourrait être utilisé pour dépister les nombreux petits échantillons provenant d’une zone de prélèvement similaire pour l’échantillon global à grande échelle. Cela pourrait surmonter certaines des lacunes d’un petit échantillon et déterminer des informations supplémentaires sur la distribution spatiale de l’agent pathogène dans le domaine. En outre, la portabilité et la rapidité de la méthode signifie qu’il peut également servir à des activités de démonstration aux producteurs pour l’éducation et fins de l’engagement.

Une autre considération est que de nombreux tests de PCR en temps réel sont déjà publiées pour un large éventail d’ agents pathogènes de plantes5. Ce système peut faire usage de ces tests existants sans avoir besoin de concevoir de nouvelles amorces de lampe à activer dans les essais sur le terrain. Une critique fréquente des dosages de la lampe, c’est qu’ils peuvent être difficiles à concevoir le31. Portable PCR, permet donc la mise en œuvre relativement facile d’un large éventail de tests de pathogènes facilement disponibles pour les essais sur place.

Les méthodes traditionnelles peuvent être souvent coûteux, laborieux, inexactes et chronophage. La simplicité de la méthode sur place, que nous avons développé permet aux producteurs et aux travailleurs de l’industrie effectuer la détection de pathogènes par eux-mêmes et peut-être générer un résultat beaucoup plus rapide que l’envoi à un laboratoire de diagnostic qui pourrait être à quelque distance de là. La rapidité et la sensibilité de la méthode PCR portable peuvent aider les producteurs éviter des infections secondaires, qui peuvent encore augmentent de la population de l’agent pathogène et la propagation involontaire (via les équipements ou les humains). En conclusion, la méthode sur le site développée dans la présente étude permet précise et relativement sensible de détection des agents pathogènes telluriques importants dans le domaine. Notre espoir est que la méthode sur le site développée dans cette étude contribuera à un pipeline de diagnostic actuel (Figure 6), non seulement en fournissant des réponses rapides et précises aux questions épidémiologiques sur les maladies des plantes sur le terrain, mais aussi en fournissant des une meilleure compréhension de la biologie et l’épidémiologie des agents phytopathogènes.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous sommes reconnaissants à m. Neil C. Gudmestad à North Dakota State University pour la fourniture de S. subterranea plasmid DNA, Dr Hanu Pappu à Washington State University (UWS) pour la fourniture de l’ARN PMTV et le Dr Debra Inglis WSU permettant de r. solani AG3. Merci à Dr Jeremy Jewell à WSU pour fournir des commentaires sur le manuscrit et la WSU CAHNRS Communications pour la vidéographie. Cette recherche a été financée par le Consortium de recherche du Nord-Ouest de pommes de terre et le Washington State Department of Agriculture – programme de subvention globale de récolte spécialisés (subvention no. K1764). BCP no 0741, Department of Plant Pathology, Collège d’Agriculture, Sciences humaines et des ressources naturelles, centre de recherche agricole, Hatch projet no WNP00833, Washington State University, Pullman, WA, USA.

Materials

White shell PCR plate Bio-Rad HSP9601
CFX Manager Bio-Rad 1845000
SsoAdvanced Universal Probes Supermix  Bio-Rad 1725280
CFX96 Touch qPCR instrument Bio-Rad  1855195
Ethylalcohol, pure 200 proof Decon Laboratories 04-355-222
Masterclear cap strips & real‑time PCR tube strips Eppendorf 9510222109
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) Fisher BioReagents BP118-500
Phenol, Saturated  Fisher BioReagents BP1750I-400
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Fisher BioReagents BP152-5
q16 real-time PCR machine genesig MBS486001
Ultrapure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Invitrogen 15525-017
2-Propanol (Isopropanol) JT Baker 67-63-0
Chloroform JT Baker 9180-03
Hydrochloric Acid, 36.5-38.0% (HCl) JT Baker 9535-03
iso-Amyl Alcohol JT Baker 9038-01
FastDNA Spin kit  MP Biomedicals 6560-200 Silica-based DNA extraction kit #1
Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit New England Biolabs E3005S
0.1ml Low Profile Individual PCR Tubes Phenix Research MPC-100LP
Easy DNA/RNA Extraction Kit  Primerdesign genesigEASY-EK
genesig Easy 1.5 mL tubes Primerdesign genesigEASY-1.5
Magnetic tube rack Primerdesign genesigEASY-MR
Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy Kit Primerdesign Path-S.subterranea-EASY
Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) Sigma-Aldrich H6269-100G
Pellet pestles Thermo Fisher Scientific 12-141-364
Sodium chloride (NaCl) Thermo Fisher Scientific 7647-14-5
DNA Miniprep kit  ZymoBIOMICS D4300 Silica-based DNA extraction kit #2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malcolm, G. M., Kuldau, G. A., Gugino, B. K., Jiménez-Gasco, M. d. e. l. M. Hidden Host Plant Associations of Soil-borne Fungal Pathogens: An Ecological Perspective. Phytopathology. 103 (6), 538-544 (2013).
  2. Posthuma-Trumpie, G. A., Korf, J., van Amerongen, A. Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey. Anal Bioanal Chem. 393 (2), 569-582 (2009).
  3. Hill, J., et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Common Strains of Escherichia coli. J Clin Microbiol. 46 (8), 2800-2804 (2008).
  4. Mumford, R. A., Walsh, K., Barker, I., Boonham, N. Detection of Potato mop top virus and Tobacco rattle virus Using a Multiplex Real-Time Fluorescent Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction Assay. Phytopathology. 90 (5), 448-453 (2000).
  5. Schena, L., Nigro, F., Ippolito, A., Gallitelli, D. Real-time quantitative PCR: a new technology to detect and study phytopathogenic and antagonistic fungi. European Journal of Plant Pathology. 110 (9), 893-908 (2004).
  6. Brierley, J. L., Stewart, J. A., Lees, A. K. Quantifying potato pathogen DNA in soil. Applied Soil Ecology. 41 (2), 234-238 (2009).
  7. Tomlinson, J. A., Boonham, N., Hughes, K. J. D., Griffin, R. L., Barker, I. On-Site DNA Extraction and Real-Time PCR for Detection of Phytophthora ramorum in the Field. Appl Environ Microbiol. 71 (11), 6702-6710 (2005).
  8. Harrison, J. G., Searle, R. J., Williams, N. A. Powdery scab disease of potato – a review. Plant Pathology. 46 (1), 1-25 (1997).
  9. Johnson, D. A., Miliczky, E. R. Distribution and development of black dot, Verticillium wilt, and powdery scab on Russet Burbank potatoes in Washington State. Plant Disease. 77 (1), 74-79 (1993).
  10. Merz, U. Powdery Scab of Potato-Occurrence, Life Cycle and Epidemiology. Am J Pot Res. 85 (4), 241 (2008).
  11. Jones, R. a. C., Harrison, B. D. The behaviour of potato mop-top virus in soil, and evidence for its transmission by Spongospora subterranea (Wallr). Lagerh. Annals of Applied Biology. 63 (1), 1-17 (1969).
  12. Carnegie, S. F., Davey, T., Saddler, G. S. Effect of temperature on the transmission of Potato mop-top virus from seed tuber and by its vector, Spongospora subterranea. Plant Pathology. 59 (1), 22-30 (2010).
  13. Woodhall, J. W., Adams, I. P., Peters, J. C., Harper, G., Boonham, N. A new quantitative real-time PCR assay for Rhizoctonia solani AG3-PT and the detection of AGs of Rhizoctonia solani associated with potato in soil and tuber samples in Great Britain. Eur J Plant Pathol. 136 (2), 273-280 (2013).
  14. Banville, G. J. Yield losses and damage to potato plants caused by Rhizoctonia solani Kuhn. American Potato Journal. 66 (12), 821-834 (1989).
  15. Crosslin, J. M. First Report of Potato mop-top virus on Potatoes in Washington State. Plant Disease. 95 (11), 1483-1483 (2011).
  16. Whitworth, J. L., Crosslin, J. M. Detection of Potato mop top virus (Furovirus) on potato in southeast Idaho. Plant Disease. 97 (1), 149-149 (2012).
  17. Kaur, N., Cating, R. A., Dung, J. K. S., Frost, K. E., Robinson, B. A., Hamm, P. B. First Report of Potato mop-top virus Infecting Potato in Oregon. Plant Disease. 100 (11), 2337 (2016).
  18. Doyle, J. J. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12, 13-15 (1990).
  19. Dellaporta, S. L., Wood, J., Hicks, J. B. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Mol Biol Rep. 1 (4), 19-21 (1983).
  20. Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Research. 19 (6), 1349 (1991).
  21. Bittara, F. G., Secor, G. A., Gudmestad, N. C. Chloropicrin Soil Fumigation Reduces Spongospora subterranea Soil Inoculum Levels but Does Not Control Powdery Scab Disease on Roots and Tubers of Potato. Am J Potato Res. 94 (2), 129-147 (2017).
  22. van de Graaf, P., Lees, A. K., Cullen, D. W., Duncan, J. M. Detection and Quantification of Spongospora subterranea in Soil, Water and Plant Tissue Samples Using Real-Time PCR. European Journal of Plant Pathology. 109 (6), 589-597 (2003).
  23. Maldonado, H., Falloon, R. E., Butler, R. C., Conner, A. J. Spongospora subterranea root infection assessed in two potato cultivars differing in susceptibility to tuber powdery scab. Plant Pathology. 62 (5), 1089-1096 (2013).
  24. Braid, M. D., Daniels, L. M., Kitts, C. L. Removal of PCR inhibitors from soil DNA by chemical flocculation. Journal of Microbiological Methods. 52 (3), 389-393 (2003).
  25. Lees, A. K., Cullen, D. W., Sullivan, L., Nicolson, M. J. Development of conventional and quantitative real-time PCR assays for the detection and identification of Rhizoctonia solani AG-3 in potato and soil. Plant Pathology. 51 (3), 293-302 (2002).
  26. Davey, T., Carnegie, S. F., Saddler, G. S., Mitchell, W. J. The importance of the infected seed tuber and soil inoculum in transmitting Potato mop-top virus to potato plants. Plant Pathol. 63 (1), 88-97 (2014).
  27. Boonham, N., et al. Methods in virus diagnostics: From ELISA to next generation sequencing. Virus Research. 186, 20-31 (2014).
  28. Mohan, S. B. Cross-reactivity of antiserum raised against Phytophthora fragariae with other Phytophthora species and its evaluation as a genus-detecting antiserum. Plant Pathology. 38 (3), 352-363 (1989).
  29. Ophel-Keller, K., McKay, A., Hartley, D., Curran Herdina, J. Development of a routine DNA-based testing service for soil-borne diseases in Australia. Austral Plant Pathol. 37 (3), 243-253 (2008).
  30. Woodhall, J. W., et al. A new large-scale soil DNA extraction procedure and real-time PCR assay for the detection of Sclerotium cepivorum in soil. Eur J Plant Pathol. 134 (3), 467-473 (2012).
  31. Miles, T. D., Martin, F. N., Coffey, M. D. Development of Rapid Isothermal Amplification Assays for Detection of Phytophthora spp in Plant Tissue. Phytopathology. 105 (2), 265-278 (2014).
  32. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), e63-e63 (2000).
  33. Narayanasamy, P. . Microbial Plant Pathogens: Detection and Management in Seeds and Propagules. , (2016).
  34. Braun-Kiewnick, A., Altenbach, D., Oberhänsli, T., Bitterlin, W., Duffy, B. A rapid lateral-flow immunoassay for phytosanitary detection of Erwinia amylovora and on-site fire blight diagnosis. Journal of Microbiological Methods. 87 (1), 1-9 (2011).

Tags

On-site DetectionSoil-borne PhytopathogensPortable Real-time PCRMagnetic Bead-based DNA ExtractionPotato PathogensSpongospora SubterraneaField DiagnosisPlant Pathogen Detection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
DeShields, J. B., Bomberger, R. A., Woodhall, J. W., Wheeler, D. L., Moroz, N., Johnson, D. A., Tanaka, K. On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System. J. Vis. Exp. (132), e56891, doi:10.3791/56891 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image