الكينماتيكا العين التي تقاس في المختبر حفز الأعصاب في السلحفاة
Summary
هذا البروتوكول يصف كيفية استخدام في المختبر معزولة سلحفاة رأس إعداد لقياس الكينماتيكا تحركاتهم العين. بعد إزالة الدماغ من الجمجمة، ويمكن حفز أعصاب مع التيارات التحديد الكمي لتناوب العين والتغيرات في أحجام التلميذ.
Abstract
بعد هي euthanized الحيوانات، يبدأ أنسجتها للموت. سلاحف توفر ميزة بسبب فترة بقاء أطول لانسجتها، خاصة عند مقارنتها بالفقاريات ذوات الدم الحار. وبسبب هذا، يمكن إجراء التجارب في المختبر في السلاحف لفترات طويلة من الوقت للتحقيق في الإشارات العصبية والسيطرة على أفعالهم المستهدفة. تستخدم إعداد رأس معزولة، قمنا بقياس علم الحركة حركات العين في السلاحف، والتحوير واسطة إشارات كهربائية يحملها أعصاب. بعد أن تمت إزالة الدماغ من الجمجمة، ترك الأعصاب سليمة، وضعت رأسه تشريح في انحراف لمعايرة حركات العين. زجاج كهربائي تم إرفاقه أعصاب (أوكولوموتور، تروتشلير، ومبعد) وحفز مع التيارات تثير حركات العين. نحن رصد حركات العين مع شريط فيديو الأشعة تحت حمراء على تتبع النظام وتناوب كمياً للعيون. البقول الحالية مع طائفة من الاتساع، الترددات، واستخدمت القطار المدد الزمنية لمراقبة آثار على الردود. لأنه يتم فصل الإعداد من الدماغ، يمكن النظر في مسار الإضافة الذهاب إلى أهداف العضلات بمعزل عن التحقيق في الإشارات العصبية في غياب المعلومات الحسية المجهزة مركزياً.
Introduction
الأساس المنطقي لاستخدام المنزلق الأحمر ذو اذنين السلاحف في التجارب الكهربية:
تعتبر واحدة من العالم أسوأ الأنواع الغازية1 المنزلق الأحمر ذو اذنين السلاحف (ايليجانس سكريبتا تراتشيميس)، ويمكن أن يشير إلى أن النظام إيكولوجي في مأزق. هو غير مفهومة السبب المنزلق الأحمر ذو اذنين السلاحف ناجحة جداً ولكن قد يكون جزئيا سبب فسيولوجيا متسامح وحيازتها لانسجة الجهاز العصبي التي يمكن البقاء على قيد الحياة تحت ظروف التاكسج2،3،4 . استخدام لهم للتجريب لا تهدد أعدادهم ومع الحد الأدنى من الجهود، الاستعدادات الكهربية يمكن أن تظل قابلة للتطبيق على مدى فترات ممتدة، ما دام 18 ساعة5،6. الفائدة مماثلة للاستفادة من استخدام الحيوانات اللافقارية مثل جراد البحر7، التي لديها أيضا القدرة على تحمل مستويات منخفضة من الأكسجين8.
تقنيات لقياس حركات العين:
وقد نهج لقياس حركات العين في الحيوانات العينين أمامي استخدام الرئيسيات غير البشرية نمواً جيدا9. العين تدور في المدار حول ثلاثة محاور: الأفقي والرأسي، والالتوائيه. الطريقة لفائف البحث المغناطيسي يعتبر عموما الأكثر موثوقية لتناوب قياس، ولكن الغازية، التي تتطلب لفائف صغيرة يمكن إدراجه في سكليراس من الحيوانات10،11. الأنظمة المستندة إلى الفيديو كما يمكن قياس عمليات التناوب ولها ميزة كونها غير الغازية. وعززت تنمية أفضل الكاميرات جنبا إلى جنب مع معالجة الصور المبتكرة وظائفها مما يجعل الأنظمة المستندة إلى الفيديو بديلاً جذاباً للنظر في12،،من1314.
التقنيات المتقدمة لقياس حركات العين في نونمامالس كانت كبيرة أقل بكثير. التدابير هي أما ذات الدقة المنخفضة أو وصف بعض تناوب15،16،،من1718فقط. الافتقار إلى التنمية يمكن يمكن توجيه اللوم جزئيا على الصعوبة في نونمامالس التدريب لمتابعة الأهداف المرئية. على الرغم من أن حركات العين وقد درست جيدا في منزلق الأحمر ذو اذنين السلاحف19،20،21،،من2223،24،25 ،26،،من2728،،من2930، بسبب التحدي في تدريب الحيوانات لتعقب الأهداف، الكينماتيكا دقيقة تحركاتهم العين ضعيف ومن المفهوم.
المنزلق الأحمر ذو اذنين السلاحف تعتبر عموما الفقاريات العينين الجانبية, ولكن نظراً لأنهم تماما سحب رؤوسهم في شل على31، انسداد هام الحقول البصرية الأفقي بحسب يحدث32. والنتيجة أن يجبر على خط الرؤية البصرية تجاه الجبهة، مما يجعلهم يتصرفوا أكثر الثدييات العينين أمامي. ولذلك، يوفر استخدامها كنموذج لوضع نهج لقياس حركات العين أيضا من منظور تطوري فريدة من نوعها.
يستخدم البروتوكول هو موضح في هذا العمل في المختبر عزل رئيس إعداد لتحديد الكينماتيكا حركات العين في منزلق الأحمر ذو اذنين السلاحف. يتم تشريح أدمغة من الجماجم ترك الأعصاب سليمة. يتم وضع رؤساء إلى انحراف معايرة حركات العين وتثير ردود بالتحفيز الكهربائي لاعصاب إينيرفاتينج في عضلات العين. تدابير للتناوب بالعيون تتم بنظام الفيديو القائم، باستخدام خوارزميات البرمجيات، التي تتبع التلميذ الظلام وعلامات القزحية. الإعداد يتيح الفرصة لقياس الكينماتيكا على حد سواء اكستراوكولار (أي، تناوب الأفقي والرأسي، والالتوائيه)32 والعين (أي، التغييرات التلميذ) حركات33 .
نظام نموذجي لتحليل المسارات العصبية ناقل:
وبصورة أعم، يوفر النهج المحققين فرصة لدراسة كيفية ناقل الإشارات العصبية توليد حركات العين عند بدء العضلات من دولهم استرخاء، وفي غياب المعلومات الحسية المتكاملة معالجتها بواسطة الدماغ32، 33. ولذلك، يمكن فحص الكينماتيكا العين في نظام نموذجي الذي يتم معالجتها فقط بالمسار العصبية ناقل ترك الدماغ وسينابسينج على العضلات.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوات حاسمة:
الخطوات الحاسمة ضمن هذا البروتوكول ما يلي: 1) التشريح والعناية للحفاظ على استمرارية الأعصاب بحف؛ 2) مطابقة الأحجام بأقطاب كهربائية شفط إلى أعصاب تقديم استجابات متسقة؛ و 3) موضع الرأس في انحراف لتوفير المعايرة كافية للتناوب للعين.
استكشاف الأخطاء وإصل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون السيدة بوليت ماكينا وليزا بيزينو في هذه الدراسة لدعم أعمال السكرتارية، والسيد فيل اورباخ للدعم التقني. كما يشكر المؤلفون الدكتور مايكل أرييل ومايكل س. جونز (جامعة سانت لويس مدرسة للطب) على تقديمه لنا بإعداد رأسه في المختبر معزولة. وقدمت التمويل لدعم هذا التعاون بقسم علم الأحياء (روبرت س. تشيس الصندوق) ولجنة الأبحاث الأكاديمية وبرنامج علم الأعصاب في كلية لافاييت. وأخيراً، هذا العمل مكرس للسيد فيل اورباخ، الذي وافته المنية في 28 سبتمبر 2016؛ الاستغناء المسح الإلكتروني المجهري، وأقر بفائدة المرحلة 5-محور للاستخدام في هذا البروتوكول. وسيفتقد كثيرا عن الصداقة والحيلة.
Materials
| Red-eared slider turtles | Kons Scientific | Trachemys scripta elegans | Large size (carapace length 15-20 cm) |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5886 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | P5405 | |
| Magnesium choride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | M7304 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5761 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C5767 | |
| Concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich Co. LLC. | H7020 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C7902 | |
| pH meter | Oakton | pH 6+ | |
| Suction stimulation electrode | A-M Systems | 573000 | Bipolar suction electrode. Note that 573000 has been replaced with 573050. |
| Capillary glass | A-M systems | 626000 | Single-barrel borosilicate capillary glass without microfilament, length 10 cm, outside diameter 1.0 mm, inner diameter 0.50 mm |
| Alternative suction stimulation electrode | A-M Systems | 573050 | Bipolar suction electrode. Requires larger diameter capillary glass: 627000, outside diameter 1.2 mm, inner diameter 0.68 mm |
| Stereoscope | Lieca | GZ7 | Magnification range, 10x – 70x |
| Fiber optic light source | Amscope | HL250-A | 150W Fiber optical microscope illuminator light box |
| Rongeurs | Carolina Biological Supply Company | 625654 | stainless steel, straight spring, 5.25" |
| Blunt dissection probe | Carolina Biological Supply Company | 627405 | Huber mall probe, double-ended probe and seeker, 6" |
| Microscissors | Carolina Biological Supply Company | 623555 | Iris microdissecting scissors, stainless steel, 0.5" blades, 4.75" long |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich Co. LLC. | F6521 | Jewelers forceps, dumont No. 5, inox alloy, 4.25" |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich Co. LLC. | Z168696 | Medium tip, curved forceps, stainless steel, 4" |
| Scalpel handle | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2896 | Scalpel handles, No. 3, stainless steel |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2771 | Scalpel blades, No. 11, steel |
| Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1918 | Kleine guillotine type 7575 |
| Spatula | Sigma | Z648299 | Micro spoon and spatula weighing set. Use small spatula: 5.9” long x 0.07” diameter handle with square end: 0.17” x 1.3” long, other end round: 0.17” x 1.27” long |
| Hook | Autozone | 98069 | SureBilt hook and pick set. Use grinder to dull sharp points of hook to prevent injury to animals mouth. |
| 95/5% O2/CO2 | Airgas, Inc. | X02OX95C2003102 | 5% Carbon dioxide balance oxygen certified standard gas mixture, size 200 Cylinder, CGA-296 |
| Regulator | Airgas, Inc. | Y11244D296-AG | Single stage brass 0-100 psi analytical cylinder regulator CGA-296 with needle outlet. Use brass adjustable airline pipe valve to go from 3/8", inner diameter, vinyl airline tubing connected to regulator to a 3/16", inner diameter, airline connection going to airstone or glass pasteur pipette. |
| Adjustable airline pipe valve | Doctors Foster and Smith | CD-12061 | Brass valve |
| Rigid table | Unknown | Unknown | Auto-clave door laid on top of a sturdy table. Nine 5" diameter tennis balls isolate vibrations from the top surface of the table. |
| 5" tennis ball | Petco Animal Supplies, Inc. | 712868 | Petco Jumbo Pet Tennis Ball: balls are unsliced and held within an integrated frame on the underside part of the autoclave door. |
| Alternative vibration isolation table | Newport Corporation | INT1-36-6-N | Rigid vibration control system, integrity 1: Surface dimensions, 3' x 6' |
| Gimbal | ISI, International Scientific Instruments, Inc. | Stage from SUPER III-A Scanning EM | 5-axis eucentric stage: X, Y, and Z linear movements, ±20 mm, 0.1 mm precision; Rotations, vertical, ±10°, and horizontal, ±12.5°, with 1.25° precision. Note: from decommission instrument. |
| Chuck for gimbal | Unknown | Unknown | Chuck from an old microtome of unknown manufacture was machined to fit the shaft of the specimen holder of the Scanning EM stage |
| Alternative gimbal | ThorLabs, Inc. | GN2/M with MBT602/M | Dual-axis goniometer (GN2/M) mounted on 3-axis microblock stage with thumbscrew adjusters (MBT602/M): design a chuck to hold turtle head with eye at 12.7 mm above top surface of goniometer (distance to point of rotation) |
| Video-based eye tracking system | Arrington Research, Inc. | ViewPoint EyeTracker, PC-60 | Tracking method: Infrared video by dark pupil; Black and white camera (Item BC02): 30 Hz, 640 x 480; System requirements: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Visual range: Horizontal +/- 44°; vertical +/- 20°; Accuracy ~0.5°; Spatial resolution ~0.15°; Pupil size resolution ~0.03 mm; Eye data: X, Y position of gaze, pupil height and width, torsion, delta time, total time, and regions of interest (ROI); Real-time communication (Item 0022): 4-Channel AnalogOut with eight TTL input channels to mark codes into the data file |
| Multi-position magnetic base | Harbor Freight Tools | Pittsburg, item #5645 | Magnetic holder reaches up to 12" and produces 45 lbs. of magnetic pull. Use to position camera. Machine thread holes onto the end of the rod to mount cameras. |
| Micromanipulator | Kopf | 900 | 5 axis manipulation for mount of suction electrode: X, Y, Z linear travel, 2 axis of rotation |
| Dissection scope on boom | Lieca | GZ6 | Magnification range, 6.7x – 40x |
| Nerve/muscle stimulator | Astro-Med Grass Telefactor | Grass S88 | Dual pulse voltage stimulator: two output channels that can be operated independently or synchronized to generate non-isolated constant voltage pulses (10 mv to 150 V). Pulses can be single (10 μsec to 10 sec), repetitive (0.01 Hz to 1 KHz), and trains (1 ms to 10 s) and synchronized with TTL inputs and output. Send TTL outputs via the output channels of a DB25 connector to the TTL input channels of the ViewPoint EyeTracker. Note: Astro-Med Grass Telefactor is no longer in business. |
| Current isolation device | Astro-Med Grass Telefactor | PSIU6 | Current stimulus isolation unit: enables safe delivery of constant currents by the S88 to the preparation. The PSIU6 connects by a BNC cable to one of the output channels of the S88. Multiplier switches on the PSIU6 allow the S88 to generate a wide array of current amplitudes ranging from 0.1 µA to 15 mA. |
| Alternative nerve/muscle stimulator with isolation | A-M Systems | 2100 | Isolated Pulse Stimulator: Unit has built-in isolator to produce constant currents. |
References
- Kikillus, K. H., Hare, K. M., Hartley, S. Minimizing false-negatives when predicting the potential distribution of an invasive species: A bioclimatic envelope for the red-eared slider at global and regional scales. Anim Conserv. 13, 5-15 (2010).
- Lutz, P. L., Rosenthal, M., Sick, T. J. Living without oxygen: turtle brain as a model of anaerobic metabolism. Mol Physiol. 8, 411-425 (1985).
- Lutz, P. L., Milton, S. L. Negotiating brain anoxia survival in the turtle. J Exp Biol. 207, 3141-3147 (2004).
- Storey, K. B. Anoxia tolerance in turtles: Metabolic regulation and gene expression. Comp Biochem Physiol A-Mol Integr Physiol. 147 (2), 263-276 (2007).
- Granda, A. M., Dearworth, J. R., Subramaniam, B. Balanced interactions in ganglion-cell receptive fields. Vis Neurosci. 16, 319-332 (1999).
- Dearworth, J. R., Granda, A. M. Multiplied functions unify shapes of ganglion-cell receptive fields in retina of turtle. J Vis. 2 (3), 204-217 (2002).
- Nesbit, S. C., Van Hoof, A. G., Le, C. C., Dearworth Jr, J. R. Extracellular recording of light responses from optic nerve fibers and the caudal photoreceptor in the crayfish. J Undergrad Neurosci Educ. 14 (1), A29-A38 (2015).
- McMahon, B. R. Respiratory and circulatory compensation to hypoxia in crustaceans. Resp Phsiol. 128 (3), 349-364 (2001).
- Leigh, R. J., Zee, D. S. . The neurology of eye movements. , (1999).
- Robinson, D. A. A method of measuring eye movement using a scleral search coil in a magnetic field. IEEE Trans Biomed Eng. 10, 137-145 (1963).
- Judge, S. J., Richmond, B. J., Chu, F. C. Implantation of magnetic search coils for measurement of eye position: an improved method. Vis Res. 20, 535-538 (1980).
- Ong, J. K. Y., Halswanter, T. Measuring torsional eye movements by tracking stable iris features. J Neurosci Meth. 192, 261-267 (2010).
- Kimmel, D. L., Mammo, D., Newsome, W. T. Tracking the eye non-invasively: simultaneous comparison of the scleral search coil and optical tracking techniques in the macaque monkey. Front Behav Neurosci. 6 (49), 1-17 (2012).
- Otero-Millan, J., Roberts, D. C., Lasker, A., Zee, D. S., Kheradmand, A. Knowing what the brain is seeing in three dimensions: A novel, noninvasive, sensitive, accurate, and low-noise technique for measuring ocular torsion. J Vis. 15 (14), 1-15 (2015).
- Demski, L. S., Bauer, D. H. Eye movements evoked by electrical stimulation of the brain in anesthetized fishes. Brain Behav Evol. 11, 109-129 (1975).
- Gioanni, H., Bennis, M., Sansonetti, A. Visual and vestibular reflexes that stabilize gaze in the chameleon. Vis Neurosci. 10, 947-956 (1993).
- Straka, H., Dieringer, N. Basic organization principles of the VOR: lessons from frogs. Prog Neurobio. 73 (4), 259-309 (2004).
- Voss, J., Bischof, H. -. J. Eye movements of laterally eyed birds are not independent. J Exp Biol. 212 (10), 1568-1575 (2009).
- Ariel, M. Independent eye movements in the turtle. Vis Neurosci. 5, 29-41 (1990).
- Ariel, M., Rosenberg, A. F. Effects of synaptic drugs on turtle optokinetic nystagmus and the spike responses of the basal optic nucleus. Vis Neurosci. 7, 431-440 (1991).
- Balaban, C. D., Ariel, M. A “beat-to-beat” interval generator for optokinetic nystagmus. Biol Cybern. 66, 203-216 (1992).
- Keifer, J. In vitro eye-blink reflex model: Role of excitatory amino acid receptors and labeling of network activity with sulforhodamine. Exp Brain Res. 97, 239-253 (1993).
- Keifer, J., Armstrong, K. E., Houk, J. C. In vitro classical conditioning of abducens nerve discharge in turtles. J Neurosci. 15, 5036-5048 (1995).
- Rosenberg, A. F., Ariel, M. A model for optokinetic eye movements in turtles that incorporates properties of retinal slip neurons. Vis Neurosci. 13, 375-383 (1996).
- Ariel, M. Open-loop optokinetic responses of the turtle. Vis Res. 37, 925-933 (1997).
- Anderson, C. W., Keifer, J. Properties of conditioned abducens nerve responses in a highly reduced in vitro brainstem preparation from the turtle. J Neurophysiol. 81, 1242-1250 (1999).
- Keifer, J. In vitro classical conditioning of the turtle eyeblink reflex: Approaching cellular mechanisms of acquisition. Cerebell. 2, 55-61 (2003).
- Zhu, D., Keifer, J. Pathways controlling trigeminal and auditory nerve-evoked abducens eyeblink reflexes in pond turtles. Brain Behav Evol. 64, 207-222 (2004).
- Jones, M. S., Ariel, M. The effects of unilateral eighth nerve block on fictive VOR in the turtle. Br Res. 1094, 149-162 (2006).
- Jones, M. S., Ariel, M. Morphology, intrinsic membrane properties, and rotation-evoked responses of trochlear motoneurons in the turtle. J Neurophysiol. 99 (3), 1187-1200 (2008).
- Krenz, J. G., Naylor, G. J. P., Shaffer, H. B., Janzen, F. J. Molecular phylogenetics and evolution of turtles. Mol Phylogenet Evol. 37 (1), 178-191 (2005).
- Dearworth, J. R., et al. Role of the trochlear nerve in eye abduction and frontal vision of the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans). J Comp Neur. 52, 3464-3477 (2013).
- Dearworth, J. R., et al. Pupil constriction evoked in vitro by stimulation of the oculomotor nerve in the turtle (Trachemys scripta elegans). Vis Neurosci. 26, 309-318 (2009).
- Mead, K., et al. IFEL TOUR: a description of the introduction to FUN electrophysiology labs workshop at Bowdoin College, July 27-30, and the resultant faculty learning community. J Undergrad Neurosci Educ. 5, A42-A48 (2007).
- Jackson, D. C., Ultsch, G. R. Physiology of hibernation under the ice by turtles and frogs. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 313 (6), 311-327 (2010).
- Romano, J. M., Dearworth, J. R. Pupil constriction evoked by stimulation of the ciliary nerve in the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans). J Penns Acad Sci. 85, 4-8 (2011).
- Miller, J. M., Robins, D. Extraocular-muscle forces in alert monkey. Vis Res. 32, 1099-1113 (1992).
- Gamlin, P. D., Miller, J. M. Extraocular muscle motor units characterized by spike-triggered averaging in alert monkey. J Neurosci Meth. 204, 159-167 (2011).
- Quaia, C., Ying, H. S., Optican, L. M. The Viscoelastic properties of passive eye muscle in primates. III: Force elicited by natural elongations. PLOS ONE. 5, A236-A254 (2010).
- Anderson, S. R., et al. Dynamics of primate oculomotor plant revealed by effects of abducens microstimulation. J Neurophys. 101, 2907-2923 (2009).
- Maxwell, J. H., Harless, M., Morlock, H. Anesthesia and surgery. Turtles: Perspective and Research. , 127-152 (1979).
- AVMA Panel on Euthanasia. American Veterinary Medical Association. J Am Vet Med Assoc. 218 (5), 669-696 (2001).
- Clarke, R. J. Shaping the pupil’s response to light in the hooded rat. Exp Br Res. 176, 641-651 (2007).
- Bennett, R. A. A review of anesthesia and chemical restraint in reptiles. J Zoo Wild Med. 22 (3), 282-303 (1991).
- Bickler, P. E., Buck, L. T. Hypoxia Tolerance in Reptiles, Amphibians, and Fishes: Life with Variable Oxygen Availability. Ann Rev Physiol. 69, 145-170 (2007).
