En roman In Vitro sår Healing Assay for at evaluere celle Migration
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at vurdere effekten af peptider for migration af bronchiale epitel celler. Denne metode giver mulighed for hurtig og meget reproducerbare opnåelse af kvantitative data om hastighed i celle migration og sår lukning.
Abstract
Formålet med dette arbejde er at vise en ny metode til at vurdere muligheden af nogle immunmodulerende molekyler, såsom antimikrobielle peptider (AMP’er), at stimulere celle migration. Vigtigere, er celle migration en trafikhastighedsbegrænsning begivenhed i løbet af sårheling processen at genskabe integriteten og normal funktion af væv lag efter skade. Fordelen ved denne metode over klassisk analysen, som er baseret på en manuelt lavet bunden i en celle éncellelag, er brugen af specielle silikone kultur indsætter giver to rum for at oprette en celle-fri pseudo såret felt med en veldefineret bredde (500 μm ). Desuden, på grund af en automatiseret billede analyse platform er det muligt at hurtigt få kvantitative data om hastighed sår lukning og celle migration. Mere præcist, bliver effekten af to frog-hud ampere på migration af bronchiale epitel celler vist. Derudover vil forbehandling af disse celler med specifikke hæmmere give oplysninger om de molekylære mekanismer bag sådanne begivenheder.
Introduction
Det er i vid udstrækning kendt at sårheling hos dyr er en grundlæggende proces at genskabe integriteten og normal funktion af væv lag efter skade1. Trods epitelial overflader udsat for det ydre miljø (fx, hud, luftveje, og mave skrifter) danner en beskyttende barriere fra fysiske og kemiske fornærmelser, dannelsen af sår kan nemt forekomme, især efter kirurgi eller mikrobielle infektioner2. Som et eksempel, kolonisering af lungevæv ved den opportunistiske bakteriel patogen Pseudomonas aeruginosa, især i cystisk fibrose (CF) syge, fører til skader på luftvejene epitel med deraf følgende respirationssvigt3, 4. Sårheling er en kompleks vært reparation mekanisme til at genoprette den normale arkitektur af en skadet væv5. Det er karakteriseret ved indledende betændelse, efterfulgt af en regenerering periode omfatter epithelialization, angiogenese og væv remodellering med kollagen produktionen og celle differentiering6,7,8 . At sikre epitelial integritet og til at styre mikrobielle spredning, producerer alle levende organismer forsvar molekyler, herunder antimikrobielle peptider (AMP’er)9,10. Sårheling proces er meget vanskeligt at simulere in vitro- på grund af manglende celle debris og komplekse interaktioner blandt forskellige celletyper. Men, in vitro- evne et peptid til at fremskynde lukningen af en pseudo-sår ved at stimulere overflytning af epitelceller er betegnende for dens evne til at helbrede en kompromitteret epitel. Faktisk, celle migration er en trafikhastighedsbegrænsning begivenhed i sårheling, og at studere faktorer, der kan påvirke celle migration vil bidrage til at målrette terapier for forbedret sårheling.
Her, leveres en yderst reproducerbare eksperimentelle assay på basis af særlige silikone kultur skær til at evaluere celle migration in vitro. Det er baseret på oprettelse af en 500 μm gap (pseudo sår) på en sammenflydende celle éncellelag. Celler på kanten af feltet kunstige “sårede” vil begynde at migrere ind i området celle-fri, danner nye celle-celle kontakter. Kultur-Indsæt repræsenterer et nyt værktøj til hurtig sårheling eksperimenter. To bassiner adskilt af en 500 μm væg er leveret, og de kan placeres korrekt, i en 3-cm parabol plade eller i godt af en 12-godt plade. Fylde hvert rum af indsatsen med en cellesuspension tillader celler til at vokse i de enkelte udpegede områder indtil sammenløbet, mens fjernelse af indsatsen vil skabe en ren celle-fri hul ca 500 μm (samme bredde som adskillelsesmuren). En ordentlig cellekulturmedium suppleret med en testforbindelsen kan derefter føjes til fadet plade/godt. Bagefter, gap lukning kan visualiseres på forskellige tidspunkter under en inverteret mikroskop, helst en udstyret med et video-kamera til billede erhvervelse. Endelig, måling af ændringer i området celle-dækket af web-baseret automatiseret image analysis program giver mulighed for kvantificering af hastigheden af sår lukning og celle migration. Samlet set er denne metode et skridt fremad med hensyn til den klassiske analyse, hvor en skramme foretages manuelt af incising sammenflydende celle encellelag med en steril nål eller en pipette tip11. Ja, den sidste procedure kan ødelægge plast bunden af fadet plade/brønd og overfladebehandling, oprettelse af rynker. Derudover har området “sårede” ikke en veldefineret bredde langs hele længden af kløften, som dette stærkt afhænger af pres fra forskere til nålen/tip. Derudover kan forrykke cellerne danne klumper af levende og døde celler på kanten af bunden; Derudover kan spredning af levende celler i området “sårede” interferere med hastigheden af celle migration, genererer ikke-reproducerbare resultater12.
Desuden, takket være en ridse billede analyse platform, kan brugere hurtigt modtager (i minutter) kvantitative data om vandrende funktionsmåden for de markerede celler uden at erhverve yderligere software. Denne platform er i stand til at analysere fase kontrast mikroskopi billeder af lav (~ 5 X), medium (~ 10 X) og høj (~ 20 X) forstørrelse. Efter at uploade en zip-fil af billeder (i *.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff format) udføres analysen automatisk for at generere en sammenfattende fil, der viser procentdelen af både celle-dækkede områder og scratch samt hastigheden af celle migration, med forskellige tidsintervaller.
I dette arbejde, ved hjælp af en frog-hud AMP-derivat, dvs Esc(1-21) og sine diastereomer Esc(1-21) – 1 c13og en bronchiale cellelinie udtrykker det funktionelle CF transmembrane ledningsevne regulator (CFTR)14,15, et eksempel på peptid-induceret celle migration sammenlignet med ubehandlet (kontrolprøverne) er fastsat. Bemærk, at luftvejene epitel og CFTR spille en afgørende rolle i at opretholde lungefunktion og sår reparation16. Derudover ved selektiv hæmmere (fx AG1478)17 af epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), beviser, at migration af bronkial celler induceret af de førnævnte peptider indebærer aktivering af EGFR12, 18 er rapporteret.
I Resumé er målet med denne procedure at vise, hvordan brugen af sådanne silikone kultur skær repræsenterer en hurtig og lettilgængeligt assay til præcist bestemme migrationen af vedhængende celler (fx bronchiale epitelceller) og den molekylære mekanismer kontrollere sådanne begivenheder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Celle migration er en væsentlig proces i mange fysiologiske og patologiske arrangementer herunder sårheling, embryonale udvikling og kræft metastaser. Den grundlæggende procedure at studere celle migration i vitro omfatter: (i) oprettelsen af en celle éncellelag, (ii) produktionen af en pseudo-sår i sammenflydende lag af celler, (iii) erobringen af billeder på forskellige tidsintervaller indtil såret lukning er nået , og (iv) analysen af billedsekvens for at kvantificere migration hastigheden af de valg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af midler fra Sapienza Universitet i Rom og den italienske cystisk fibrose Research Foundation (projekt FFC #11/2014 vedtaget af FFC delegationer fra Siena, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny og Pavia). En del af dette arbejde blev også støttet af FILAS Grant Prot. FILAS-RU-2014-1020.
Vi er taknemmelige for Dr. Loretta Ferrera (U.O.C. Getica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genova, Italien) til at give de bronchiale epitel celler.
Materials
| Minimal essential medium (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsin/EDTA 1X in PBS | Euroclone | ECB3052D | Warm at room temperature before use |
| DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS with calcium and magnesium (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi Culture-Insert 2 well | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis Image Analysis | Ibidi | 30002 | |
| PRISM software | GraphPad | version 6.0 |
References
- Enyedi, B., Niethammer, P. Mechanisms of epithelial wound detection. Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).
- Kujath, P., Kujath, C. Complicated skin, skin structure and soft tissue infections – are we threatened by multi-resistant pathogens?. Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm Pharmacol Ther. 21, 595-599 (2008).
- Chiappini, E., Taccetti, G., de Martino, M. Bacterial lung infections in cystic fibrosis patients: an update. Pediatr Infect Dis J. 33, 653-654 (2014).
- Mangoni, M. L., McDermott, A. M., Zasloff, M. Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations. Exp Dermatol. 25, 167-173 (2016).
- Lau, K., Paus, R., Tiede, S., Day, P., Bayat, A. Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing. Exp Dermatol. 18, 921-933 (2009).
- Hu, M. S., et al. Tissue engineering and regenerative repair in wound healing. Ann Biomed Eng. 42, 1494-1507 (2014).
- Ramot, Y., et al. The role of PPARgamma-mediated signalling in skin biology and pathology: new targets and opportunities for clinical dermatology. Exp Dermatol. 24, 245-251 (2015).
- Lai, Y., Gallo, R. L. AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense. Trends Immunol. 30, 131-141 (2009).
- Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature. 415, 389-395 (2002).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3, 107-124 (2011).
- Di Grazia, A., et al. The frog skin-derived antimicrobial peptide esculentin-1a(1-21)NH2 promotes the migration of human HaCaT keratinocytes in an EGF receptor-dependent manner: a novel promoter of human skin wound healing?. PLoS One. 10, e0128663 (2015).
- Di Grazia, A., et al. D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions. Amino Acids. 47, 2505-2519 (2015).
- Cappiello, F., et al. Esculentin-1a-derived peptides promote clearance of Pseudomonas aeruginosa internalized in bronchial cells of cystic fibrosis patients and lung cell migration: biochemical properties and a plausible mode of action. Antimicrob Agents Chemother. 60, 7252-7262 (2016).
- Bebok, Z., et al. Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers. J Physiol. 569, 601-615 (2005).
- Trinh, N. T., et al. Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue. Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).
- Gan, H. K., et al. The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806. J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).
- Tokumaru, S., et al. Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).
- Tjabringa, G. S., et al. The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor. J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).
- Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).
