이 프로토콜 자석 입자의 합성 및 역동적이 고 전기 이동 산란을 통해 그들의 DNA 바인딩 속성의 평가 설명합니다. 이 방법은 그들의 증가할수록 입자 크기에서 변화를 모니터링에 집중 하 고는 입자 표면의 제타 전위 주요 바인딩에 DNA와 같은 재료의 역할.
자성 입자를 사용 하 여 DNA의 분리는 생명 공학 및 분자 생물학 연구에 높은 중요성의 필드입니다. 이 프로토콜 통해 동적 산란 (DL) 및 전기 이동 산란 (ELS) 바인딩 DNA-마그네틱 입자의 평가 설명 합니다. DL 분석 입자 크기, 증가할수록, 잠재적인 제타 등 입자의 물리 화학적 특성에 귀중 한 정보를 제공 합니다. 후자의 설명 표면 입자는 DNA와 같은 재료의 정전기 바인딩에 주요 역할을 담당을 합니다. 여기, 비교 분석 3 화학 수정 미, 나노 입자와 DNA 바인딩 및 차입에 대 한 그들의 효과 이용 한다. 화학 수정에 의해 분기 polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate 및 (3-aminopropyl) triethoxysilane 조사. 이후 DNA 음 전 전시, 입자 표면의 제타 전위의 DNA 바인딩 시 줄어 전망 이다. 클러스터의 형성 입자 크기에 영향을 또한 한다. 격리에서 이러한 입자의 효율성과 DNA의 차입을 조사 하기 위하여 입자는 낮은 pH (~ 6), 이온 강도 및 탈수 환경에 DNA와 혼합 됩니다. 입자는 자석에 세척 되 고 다음 DNA는 eluted Tris HCl 버퍼에 의해 (pH = 8). DNA 복사 번호 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)를 사용 하 여 추정 된다. 제타 전위, 입자 크기, 증가할수록 및 PCR 양적 평가 하 고 비교 됩니다. DL는 통찰력과 지원 DNA 격리에 대 한 입자의 심사 과정에 새로운 관점을 추가 하는 분석 방법 이다.
DNA 분리 분자 생물학에서 가장 중요 한 단계 중 하나입니다. 핵 산 추출 방법의 개발 유전체학, metagenomics, epigenetics, 및 transcriptomics의 신흥 분야에 큰 영향을가지고. DNA 분리 등 의료 (법의학/진단 도구와 전조 생체), 바이오 응용 프로그램 및 환경 응용 프로그램 (metagenomic 생물 다양성, 병원 체, 정도와 감시)의 넓은 범위가 있다. 정화 하 고 다른 비늘 같은 혈액, 소변, 토양, 나무, 그리고 샘플의 다른 종류와 다른 자료에서 DNA를 분리 하는 수요 증가 되었습니다. 1 , 2 , 3 , 4
나노 및 마이크로 크기의 입자는 DNA 분리 및 특히 그들의 높은 표면적 때문에 적합 때 그들은 자기장에 의해 움직일 수 있다. 입자 크기, 충전 등의 물리 화학적 특성 크게 대상 생체를 바인딩할 그들의 능력을 좌우할 수 있다. 5 추가 바인딩 생체의 향상 그리고 입자를 안정화, 다른 화학 수정 (표면 코팅) 활용할 수 있습니다. 바인딩에 대 한 많은 다른 전략 공유 및 공유 비 상호 작용에 따라 분류 됩니다. 반면 입자 구성의 금속, 합금 또는 그것의 밀도, 다공성, 고 표면에 영향을 미칠 수 있는 다른 자료에 의해 지 어질 수 있다 6 입자의 크기는 직접 그들의 자화 특성 적용 됩니다. 7 거기 방법은 신뢰할 수 있는 측정 하는 작은 입자의 표면 전 하입니다. 대신, 미 끄 러 짐을 비행기 (나노 표면에서 거리)에 전기 잠재력은 측정할 수 있습니다. 8 이 값 이라고 제타 잠재 하며 그것은 DL 통해 나노-및 microparticle 안정성의 평가 위해 일반적으로 사용 되는 강력한 도구입니다. 9 의 값 뿐만 아니라 pH 이온 강도 입자의 표면 특성에 뿐만 아니라 분산 환경에 매우 의존 때문에, 그것은 또한 증명할 수이 표면 사이 상호 작용으로 인 한 변화는 입자 그리고 관심사의 분자입니다. 10
다른 한편으로, 탈수 조건 (A DNA 형태) 전시 압축된 conformations 촉진 하는 그것의 강 수 (집계) 비교 하는 경우에 일반적으로에서 DNA 구조 B DNA 형태로 발생 합니다. 정전기 (이오니아와 H-본드) 그들의 sterically 액세스할 수 인산 인해 다른 자료에 DNA의 바인딩을 제어 하는 주요 세력 그리고 질소 기지 (특히 구 아닌). 7 , 10
이 작품에서 자기 나노 입자와 미의 3 개의 대표적인 화학 수정 분석 (그림 1A). 합성 방법 및 나노 입자와 미의 화학 수정 설명 합니다. 바인딩 솔루션, DNA 강 수 (pH, 이온 강도, 그리고 탈수)의 이론적인 원리에 그 협정 DNA 바인딩 및 차입을 평가 하는 데 사용 됩니다. 정량 PCR는 대표적인 나노 입자와 미 (그림 1B)에서 DNA의 차입 효율성을 평가 하는 데 사용 됩니다. 입자 크기, 증가할수록 색인, 및 잠재적인 제타는 입자 표면 (그림 1C)에 발생 하는 물리 화학적 변화를 시각화 하는 데 사용 되는 중요 한 매개 변수. 그것은 자성 입자 표면의 화학 특성에 강조 해야 합니다. 이 프로토콜의 범위를 넘어이 단계 동안, 몇 가지 현대 기술은 화학 수정의 효율성 조사에 적용할 수 있습니다. 11 , 12 , 13 , 14 입자 표면의 적외선 스펙트럼을 평가 하 고 무료로 화학 한정자의 스펙트럼을 비교 하는 푸리에 변환 적외선 분광학 (FTIR)을 사용할 수 있습니다. 엑스레이 광전자 분광학 (XPS) 소재 표면 원소 구성 식별 하는 데 사용할 수 있는 또 다른 기술입니다. 다른 전기, 현미경, 분 광 방법 입자 합성의 품질에 빛을 발산 하 게 사용할 수 있습니다. 이 작품 DL 통해 DNA-마그네틱 입자 상호 작용을 분석 하는 새로운 관점을 강조 한다.
이 프로토콜에서 제타 잠재적인 통해 자기 입자를 DNA 바인딩 설명 하는 이론적 원리 질문에서 했다. 프로토콜 합성 및 자성 나노 입자와 미의 수정에 설명합니다. DNA 제어 및 바인딩 솔루션의 준비를 위한 방법 또한 설명 합니다. 여기에 표시 된 두 가지는 DNA 입자 상호 작용의 심사에 대 한: 양이 많은 PCR 그리고 DL 접근. DL의 입자의 물리 화학적 변화 세 가지 지표를 제공 합니다: 입자 크기, 증가할…
The authors have nothing to disclose.
체코 과학 재단 (프로젝트가 CR 17-12816S) 및 CEITEC 2020 (LQ1601)에 의해 금융 지원은 크게 인정 했다.
Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 207926 | Magnetic particle synthesis |
Iron(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 380024 | Magnetic particle synthesis |
Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8263 | Magnetic particle synthesis |
Acetone | Penta | 10060-11000 | Magnetic particle synthesis |
Sodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | W302600 | Magnetic particle synthesis |
Tetraethyl orthosilicate | Sigma-Aldrich | 131903 | Magnetic particle synthesis |
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | Magnetic particle synthesis |
Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma-Aldrich | 408727 | Magnetic particle synthesis |
Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228-M | Magnetic particle synthesis |
Ethanol | Penta | 71250-11000 | Magnetic particle synthesis |
Potassium nitrate | Sigma-Aldrich | P6083 | Magnetic particle synthesis |
Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.05012 | Magnetic particle synthesis |
ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa) | Spectrum labs | G235063 | Magnetic particle synthesis |
Overhead Stirrer | witeg Labortechnik GmbH | DH.WOS01035 | Magnetic particle synthesis |
Waterbath | Memmert GmbH + Co. | 84198998 | Magnetic particle synthesis |
Sonicator | Bandelin | 795 | Magnetic particle synthesis |
BRAND UV cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759200-100EA | Cuvette for size measurement |
BRAND cap for UV-cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759240-100EA | Cuvette caps for size measurement |
Folded Capillary Zeta Cell | Malvern | DTS1070 | Cuvette for zeta potential measurement |
Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | Device for measurement of size and zeta potential |
Infinite 200 PRO NanoQuant instrument |
Tecan | 396 227 V1.0, 04-2010 | device for measurement of DNA concentration |
SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit | Sigma-Aldrich | QR0100 | PCR kit |
Mastercycler pro S instrument | Eppendorf | 6325 000.013 | Thermocycler |
MinElute kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | DNA binding |