Synthese van matiemaatschappij 10-nm polymeer beklede gouddeeltjes voor endotheel Targeting en Drug Delivery

1. voorbereiding of aanschaf van stamoplossingen (bij kamertemperatuur worden opgeslagen of bevroren tot gebruik) Bereid een stamoplossing van 1 M natriumhydroxide (NaOH) door ontbinding van 400 mg NaOH in 10 mL ultrazuiver water op kamertemperatuur, en de materialen goed te mengen.Opmerking: Ultrapure water wordt gedefinieerd als water zonder verontreinigingen zoals deeltjes, bacteriën, nucleasen, ionen of sporen van organische stoffen. Een zuiveringsinstallatie wordt gebruikt voor het verkrijgen van de ultrapure water, resulterend in de soortelijke weerstand van maximaal 18.2 mΩ·cm, wijzen op een lage anionogene verontreiniging. Het gebruik van verkrijgbare gebotteld ultrazuiver water wordt niet aanbevolen. Voortaan zal dit ultrazuiver water worden verwezen als water, tenzij anders aangegeven. Bereiden van een stamoplossing van 6M NaOH door ontbinding 2.4 g NaOH in 10 mL water en slaat u de oplossing op kamertemperatuur. Bereid een stamoplossing van 250 mM chloroauric zuur (HAuCl4) door de ontbinding van 1 g gedroogde HAuCl4 in 10.16 mL water. Verdunnen 1 mL 250 mM HAuCl4 en 9 mL water te werken concentratie van 25 mM HAuCl4te verkrijgen. De oplossing van de4 HAuCl bij kamertemperatuur worden opgeslagen. Bereid een 0,1 M carbonaat buffer met een pH 8,8, door ontbinding van 84 mg natriumbicarbonaat in 10 mL water en pH 8,8 aanpassen door het toevoegen van 6 M NaOH van stap 1.2. De carbonaat buffer bij kamertemperatuur worden opgeslagen. Meng 20 mL tetrazolium samengestelde, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium zout (MTS), met een stabilisator, fenazine ethosulfate (PSE) (Zie Tabel van materialen). Het mengsel van MTS/PSE in aliquots (voor een maximum van 10 bevriezen-ontdooien cycli) bewaren bij-20 ° C in het donker. 2. Samenvatting van de gouden Nanoparticle kernen Bereid een verdunde THPC-oplossing door het toevoegen van 12 µL van 80% THPC in water tot 1 mL water in de buis van een microcentrifuge bij kamertemperatuur. Veilig een maatkolf van 100 mL ronde onderkant boven het midden van een magnetische roer plaat. 45 mL water giet in de kolf en roer het water op 300 rpm met behulp van een kleine ei-vormige magnetische roer bar. Voeg 0,5 mL 1 M NaOH en 1 mL verdunde THPC oplossing. Blijven roeren het reactiemengsel krachtig gedurende 5 min. Blijven roeren van het mengsel en voeg toe 2 mL 25 mM HAuCl4 oplossing. De kleur van het mengsel verandert van geel tot donkerbruin binnen seconden, die aangeeft dat de vorming van THPC AuNPs afgetopt met een negatieve lading. Roer het mengsel voor een extra 15 min te voorzien in volledige vorming van de gouden kernen. 3. de toevoeging van het polymeer Corona rond de gouden nanodeeltjes Tijdens de periode van 15 min in stap 2.3 is beschreven, bereiden de PEG oplossingen door elk van de volgende handelingen uit in 1 mL water in 4 mL glazen flesjes: 30 mg NH2-PEG-SH; 7,5 mg m-PEG-SH; 7,5 mg COOH-PEG-SH.Opmerking: De resulterende concentraties moet 8.8 M NH2-PEG-SH, 3,75 M m-PEG-SH en 3,75 M COOH-PEG-SH. Na het verminderen van de roeren snelheid van de oplossing in de kolf met ronde bodem aan 100 rpm, toevoegen dat de PEG-oplossingen voor de oplossing van THPC afgetopt AuNPs ontkleuring. Roer het mengsel voorzichtig ‘s nachts, bij kamertemperatuur, om ervoor te zorgen efficiënte verwijdering van THPC en de vervanging ervan door PEG blijven. Gebruiken voor de volgende 72 uur, een 12-14 kDa molecuulgewicht cutoff cellulose membraan te dialyze het stirred mengsel tegen een 4 L emmer water geroerd op 60 rpm. De uiteinden van de membranen binden door dialyse clips en breng de oplossing kwantitatief via pipet.Opmerking: Dit proces van de dialyse met de 12-14 kDa cutoff membraan alleen verwijdert spoorverontreiniging PEG, THPC en andere chemische reagentia, door diffusie langs een gradiënt van de concentratie. Om te handhaven van de hoge concentratie verloop en continue verspreiding te bevorderen, door het water te veranderen elke 2 h gedurende de eerste 6 uur en elke 6-12 h voor de resterende 66 h.Opmerking: Het doel van dit schema water wijzigen is aan de snelle verspreiding die vroeg op, treedt op in de aanvankelijk hoge concentratie in het monster. Het proces van dialyse beschreven hierboven bladeren de semi-gezuiverde, nanoparticle-oplossing omdat nanoparticles, precipitaten, aggregaten en andere onzuiverheden groot formaat de poriën van de 12-14 kDa cutoff membraan niet kunnen passeren. Filtreer de oplossing van de semi-gezuiverde nanoparticle in een conische buis van 50mL, met behulp van een filter van 0,2 µm spuit de resterende precipitaten, aggregaten, en andere groot formaat onzuiverheden te verwijderen. Plaats van de conische buis in een vriezer-80 ° C en laat de gezuiverde oplossing van de PEGylated AuNP (PEG-AuNP) te bevriezen voor ongeveer 5 h. Gebruik een bevriezing van de droger om te lyophilize van de gezuiverde PEG-AuNP. De droge, gezuiverde PEG-AuNP bij 4 ° C bewaren tot gebruik. 4. conjugating Fluorophores met behulp van N-hydroxysuccinimide (NHS) Ester op de NH2 groepen op de PEG-AuNP Veilig een maatkolf van 50 mL ronde onderkant boven het midden van een magnetische roer plaat. Vul de maatkolf met 18 mL water toe en roer het water op 100 rpm met behulp van een magnetische roer ei-vormige bar. Weeg 2 mg van het gelyofiliseerd PEG-AuNP in een conische buis van 4 mL, met een hoge precisie benchtop-kleurenschaal. Gebruik een anti-statische kanon om statische lading en vasthouden van het poeder van de PEG-AuNP op het oppervlak van de buis te elimineren. Voeg 2 mL water aan de buis. Giet de 2 mL PEG-AuNP oplossing in de kolf met ronde bodem voor verdere reconstructie in een totaal van 20 mL water. Roer het mengsel op 100 rpm met behulp van een magnetische roer ei-vormige bar blijven. Voeg 1 mL 0,1 M, pH 8,8 carbonaat buffer naar de 20 mL van synthetisch AuNP opgenomen in de kolf met ronde bodem. Blijven roeren. 5 µL van 10 mg/mL fluorescerende NHS ester in dimethylsulfoxide toevoegen.Opmerking: Een fluorescente kleurstof kan worden gebruikt in dit proces. Roer de fluorescerende PEG’s nachts. Houd het bij kamertemperatuur en bedekt met folie. Voor de volgende 72 h, Verwijder overtollige fluorophores met behulp van het protocol beschreven in stap 3.3. Kort, dialyze de stirred mengsel met behulp van een emmer 4 L water en een 12-14 kDa molecuulgewicht cutoff cellulose membraan. Het water veranderen elke 2 h voor de eerste 6 h en elke 6-12 uur voor de resterende 66 h. Verkrijgen van 1 mL van de gezuiverde fluorescerende PEG-AuNP oplossing, om te worden gebruikt voor de karakterisering van het onderstaande beschreven in hoofdstuk 5. Bevriezen en lyophilize van de resterende oplossing voor fluorescerende nanodeeltjes in poeder vorm voor opslag bij 4 ° C, zoals beschreven in stappen 3.5-3.7. Een 0,2 µm spuit filter te steriliseren en te verwijderen van elke potentiële precipitaten eenmaal gereconstitueerd voor cel cultuur toepassingen gebruiken. 5. de karakterisering van nanodeeltjes fluorescerende gepegyleerde goud Met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) voor het visualiseren van de gouden nanoparticle kern en kwantificeren van de maten Drop 10 µL van de gezuiverde oplossing voor fluorescerende PEG-AuNP op een koolstof gecoat netraster TEM. Na 5 min, kunt een stuk filtreerpapier zorgvuldig pit weg overtollige vocht vanaf de rand van het TEM-raster tot een film met de TL die Peg-AuNPs wordt achtergelaten. De fluorescerende PEG-AuNPs bekijken 80 kV en bij een vergroting van 50.000-150, 000. Digitale foto’s te nemen.Opmerking: Alleen de gouden kern zullen zichtbaar omdat de PEG niet elektron dicht op de TEM is. Met behulp van een meetinstrument software, stel de metingsschaal in correlatie met de schaal bar. Bereken de diameter van ongeveer 20 gouden kernen, en controleer de gemiddelde gouden kerndiameter.Opmerking: De TEM imaging systeem plaatst automatisch een schaal bar op de digitale foto’s. Meting van de hydrodynamische nanoparticle grootte met behulp van Dynamische lichtverstrooiing (DLS) Pipetteer 1 mg gelyofiliseerd THPC beklede AuNPs in een microcentrifuge buis met behulp van de in stap 4.2 beschreven aanpak. Overdracht van 1 mg van gelyofiliseerd PEG-AuNP in een aparte buis. Voeg 1 mL water aan elke buis toe en breng elke AuNP oplossing over in een doorzichtige plastic 1 mL. Plaats een cuvet in een DLS-instrument en meten van sferische hydrodynamische diameters met behulp van het deeltje analyzer software die is ingebouwd in het systeem van Distributielijsten. Plot de gemeten hydrodynamische diameters met behulp van een histogram-indeling.Opmerking: Het histogram zal nanodeeltjes groeperen op grootte. De grootste groep van nanodeeltjes zal verduidelijken de diameter die de grootte van de AuNPs gesynthetiseerd in dit protocol het best beschrijft. Fluorimetrische fluorescentie bevestigingOpmerking: Dezelfde steekproef en cuvette uit stap 5.2 kunnen worden gebruikt voor het meten van fluorescent signaal. De cuvette uit de Distributielijsten verwijderen en invoegen in een spectrofluorometer. Set de excitatie golflengte 633 nm en lees de uitgestoten fluorescentie langs een golflengtebereik van 650-800 nm signalen. Bevestigen dat de piek ongeveer 665 nm, die met de uitstoot piek voor NHS correleert.Opmerking: Pas de excitatie en emissie golflengten volgens de fluorophore gebruikt in het proces. MTS assay11 om te beoordelen van de biocompatibiliteit In een 96-Wells duidelijk onder steriele Weefselkweek behandeld plaat, Pipetteer 100 µL van de Dulbecco bewerkt Eagle’s Medium (DMEM; aangevuld met 10% foetale boviene serum en 1% penicilline/streptomycine) en 3,2 x 103 cellen in elk putje.Opmerking: In deze studie, rat vet pad endotheliale cellen worden gebruikt. Een totaal van 21 putten worden gebruikt om te voorzien in 3 replicatieonderzoeken voor elk van de 7 verschillende nanoparticle concentraties (zie stap 5.4.3 voor specifieke concentraties van belang). De cellen groeien tot confluentie in vochtigheid en 5% CO2 gecontroleerd starterscentra bij 37 ° C11toestaan. Bereiden van individuele microcentrifuge buizen, elk met 300 µL van DMEM met nanodeeltjes van verschillende concentraties. Deze studie vereist 7 verschillende buizen van DMEM met de volgende concentraties van PEG-AuNP: 0 µg Mo/mL, 10 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg Mo/mL en 1000 µg Fe/mL. De DMEM van de buis gecombineerd. Vul de putten in drievoud met 100 µL van DMEM media met 0, 10, 50, 100, 250, 500 of 1000 µg Mn/mL AuNP. Kunnen cellen en nanodeeltjes aan mede Incubeer gedurende een vooraf bepaalde tijdsduur, hier voor 16 h. Ontdooien in de buurt van het einde van de incubatieperiode, de MTS/PES mengsel uit stap 1.5. Na incubatie, gecombineerd de DMEM en de geschorste, losjes gekoppelde nanodeeltjes de putjes. Voeg 100 µL van verse DMEM samen met 20 µL van MTS/PES oplossing te verkrijgen van 1:5 MTS/PES DMEM ratio volgens protocol van de fabrikant. Incubeer de cellen met MTS/PES bij 37 ° C gedurende 2 uur.Opmerking: Deze incubatietijd 2 h wordt bepaald door de metabole activiteit van endotheliale cellen en kan worden verhoogd tot maximaal 4 uur voor andere celtypes. Binnen de periode van 2 uur, is de MTS gemetaboliseerd door de endotheliale cellen in gekleurde formazan dat vermengt zich met de DMEM. Biocompatibiliteit van PEG-AuNP en de waarschijnlijkheid van de levensvatbaarheid van de cellen zal worden aangetoond met meer gekleurde formazan. Toxiciteit van PEG-AuNP en de kans dat de cellen sterven getoond met minder intense kleur. Colorimetrische analyses van elk putje uit te voeren door het lezen van de absorptie bij 492 nm met een compatibel afleesapparaat. Bereken de gemiddelde absorptie van drievoudige extinctie waarden voor elke concentratie nanoparticle. Verdeel de gemiddelde absorptie door de waarde uit het gemiddeld extinctie in putten met 0 µg Mo/mL nanodeeltjes.Opmerking: Deze putjes waarin geen AuNPs dienen als besturingselementen voor het berekenen van de levensvatbaarheid van de cellen van het percentage in reactie op nanoparticle behandeling toegediend in andere wells. Fluorescentie confocale microscopie beoordelingvan de nanoparticle opname in aanhangend endotheliale cellen met intact of disfunctionele glycocalyx11 Zaad 1.0 x 104 cellen/cm2 rat vet pad endotheliale cellen op steriele 12 mm glas coverslips en cellen voeden met DMEM aangevuld met 10% foetale boviene serum en 1% penicilline/streptomycine. De cellen groeien tot volledige confluentie in vochtigheid en CO2 gecontroleerd starterscentra bij 37 ° C, voor ongeveer 3 dagen toestaan. Voeg behandelingen om te wijzigen de glycocalyx, indien van toepassing. Bijvoorbeeld, degradeert 2 h behandeling van de gekweekte endotheliale cellen met 2.5 x 10-6 IU heparinase III enzym de glycocalyx door specifiek het splijten van haar heparan sulfaat component.Opmerking: Gezonde glycocalyx kan worden gemodelleerd door de endotheliale cellen groeien, zoals beschreven in stap 5.5.1 zonder de toevoeging van afbraak enzymen. Incubeer de endotheliale cellen met fluorescerende AuNPs op 550 µg/mL voor 16 h of andere gewenste tijdstip met de endothelial glycocalyx intact gelaten of gesmolten disfunctionele. Voorzichtig wassen de cellen met 2 mL van 37 ° C 1% bovien serumalbumine in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; met 100 mg/L calcium en magnesium 100 mg/L). Onderdompelen van de cellen in 2 mL zuiver paraformaldehyde van 2% en 0,1% Glutaaraldehyde in PBS, en laat de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur vast te stellen. Verwijder de aldehyde fixing oplossing en wassen van de cellen met kamertemperatuur PBS voor drie 5-min cycli. Bloot endotheliale cellen 2% geit serum in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te blokkeren aspecifieke bandplaatsen voor primair antilichaam verlijmen. Cellen moeten volledig worden gedekt door de blokkerende oplossing. Incubeer endotheliale cellen overnachting met 1% anti-heparan sulfaat primair antilichaam in 2% geit serum in PBS in 4 ° C op het etiket van de heparan sulfaat component van de glycocalyx. Ervoor zorgen dat de vaste cellen volledig in contact met de antilichaam-oplossing. De volgende dag wassen het antilichaam met kamertemperatuur PBS voor drie cycli van 10 min. Incubeer de endotheliale cellen met 1:1,000 verdunning van de passende fluorescerende secundair antilichaam gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, in het donker of bedekt met aluminiumfolie. Het secundaire antilichaam met kamertemperatuur PBS wassen voor drie cycli van 10 min. Monteer het dekglaasje aan in Microscoop dia’s met behulp van een anti-fade montage medium met 4’, 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) voor kernen kleuring. Verzegel de rand van het dekglaasje aan met behulp van nagellak. Beeld de fluorescerende immunostained endothelial cel monsters met confocale microscopie, veel rode, blauwe en groene kanalen gebruiken om te visualiseren de kernen, heparan sulfaat glycocalyx en nanoparticles, respectievelijk.