Collecte et Extraction des échantillons d’Air professionnel pour l’analyse de l’ADN fongique

Exposition fongique dans les environnements d’intérieurs et au travail peut entraîner des morbidités respiratoires, y compris la sensibilisation allergique et l’asthme¹. Identification des dangers fongiques est importante pour évaluer le risque et prévenir l’exposition des travailleurs. Ces risques fongiques peuvent être le résultat d’une contamination intérieure, intrusion d’air extérieur ou perturbations environnementales qui entraînent le transport des matières fongiques dans des zones où les travailleurs sont présents². Méthodes pour évaluer l’exposition fongique ont inclus la culture viable échantillonnage ainsi que l’identification microscopique des spores fongiques. Ces approches présentent plusieurs limites et oublient souvent de nombreuses espèces de champignons qui pourraient contribuer au fardeau global fongiques³. Approches axées sur la culture peuvent différencier uniquement ces organismes fongiques viables qui peuvent être cultivées sur des milieux nutritifs. Identifier les spores fongiques au niveau de l’espèce par l’intermédiaire de la microscopie peut être confondu par des spores partage morphologies similaires. Les deux méthodes sont fortement tributaires des mycologues pour analyser et identifier les espèces de champignons, avec nombreux restent non identifiés.

Pour améliorer les méthodologies existantes utilisées dans l’identification des risques professionnels et les évaluations de l’exposition, de nombreux chercheurs se sont tournés vers technologies moléculaires. Approches axées sur les séquençage permettant d’évaluer la diversité microbienne dans les environnements intérieurs et professionnels ont mis en évidence un plus large éventail d’espèces de champignons rencontrés par rapport à des méthodes telles que la microscopie et la culture viable^{3,4 ,},⁵. La méthode présentée ici décrit l’échantillonnage de l’air des milieux professionnels et l’extraction d’ADN génomique pour l’identification des dangers potentiels de champignons. Identification des dangers est accomplie en séquençant le nucléaire ribosomique espaceur interne transcrit, ou STI, régions qui sont très variables chez les champignons et ont été utilisées pour différencier les espèces fongiques^{6,7, 8,9}. Beaucoup d’espèces trouvés dans des environnements professionnels, tels que certaines espèces appartenant au phylum Basidiomycota, ne sont pas identifiables dans la culture viable et est difficiles à différencier au microscope. Ces champignons ont été observés en grande abondance dans les environnements intérieurs et professionnels évalués par séquençage fongiques ITS régions^3,4,10. SON séquençage a fourni une plus grande connaissance de la diversité des champignons rencontrés dans les environnements intérieurs et au travail.

Le protocole décrit ici les méthodes utilisées pour recueillir, extraire et amplifier des régions ITS fongiques de bioaérosols pour l’analyse des séquences de détails. Cette approche utilise le National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) échantillonneur d’aérosol biétage cyclone recueillir des particules en suspension dans l’air. Cet échantillonneur a été développé afin de recueillir les bioaérosols et séparé respirable (≤ 4 µm de diamètre aérodynamique) et non respirables (> 4 µm de diamètre aérodynamique) particules, ce qui permet l’identification des organismes fongiques au sein d’environnements intérieurs qui sont les plus susceptibles d’être inhalées par un travailleur¹¹. Autres échantillonneurs d’air, y compris les échantillonneurs de cyclone, sont disponibles sur le marché qui ont la capacité de recueillir des particules dans la gamme respirable (< 4 µm) à l’aide de filtres^12,13. En revanche, l’échantillonneur aérosol NIOSH biétage cyclone sépare issus de leur diamètre aérodynamique dans des tubes jetables, en polypropylène qui peuvent être transformés immédiatement pour applications en aval de¹⁴espèces de champignons.

Les processus d’extraction d’ADN génomique et d’amplifier des régions ITS fongiques sont détaillées dans le présent protocole. Les méthodes d’extraction présentées ont été développés spécifiquement pour l’extraction de l’ADN génomique des champignons et des bactéries, comme beaucoup de kits commerciaux ciblent des cellules de mammifères, bactéries ou spécifiquement levures¹⁵. Les amorces utilisées dans cette étude sont choisis sur leur couverture globale des fongiques ITS 1 et 2 de ses régions^4,5. Le séquençage de ces régions permet la comparaison des nombreuses séquences ITS en banque, y compris ceux cette séquence la région ITS 1, ITS 2 région ou des régions ITS 1 tant ses 2. La diversité fongique des échantillons d’air prélevés dans un réglage intérieur à l’aide de que ces méthodes sont indiquées, révélant un grand nombre de séquences placés dans le phyla ascomycètes et basidiomycètes, mais aussi les autres séquences appartenant aux moins dominant phyla fongique, tels que Zygomycota. La grande diversité des champignons séquences identifiées à l’aide de cette approche ne serait pas être capturée à l’aide de méthodologies d’identification risque traditionnels comme la culture ou la microscopie. Le séquençage des régions ITS fongiques fournit une méthode améliorée pour identifier les risques fongiques et permettre une meilleure compréhension de l’exposition fongique intérieure et au travail.