Summary

スループットを向上させると衝撃されたオオムギ糊粉層における遺伝子発現を測定

Published: March 30, 2018
doi:

Summary

粒子衝突の後大麦アリューロン細胞の構造において、記者から一時的な遺伝子発現の測定のため改良されたプロトコルが表示されます。96 ウェル プレート酵素試金研削自動穀物の組み合わせは、プロシージャの高スループットを提供します。

Abstract

大麦糊粉層は、植物におけるホルモン調節遺伝子発現の重要なモデル システムです。アリューロン細胞における遺伝子は発芽に必要なまたはアブシジン酸 (ABA) によるストレス反応に関連する遺伝子が活性化しながら初期苗開発はジベレリン (GA) によってアクティブ化されます。GA と ABA シグナル伝達のメカニズムは、酵素試金を使用して測定結果の一時的な式で粒子衝突によるアリューロン細胞にレポーター遺伝子コンストラクトを導入することで尋問することができます。改良されたプロトコルは部分的に自動化および穀物の均質化ステップと酵素試金が合理化される既存の方法よりもはるかに多くのスループットを許可します。穀物のサンプルの均質化が、自動組織ホモジナイザーを使用して行われ、GUS (β-グルクロニダーゼ) の試金は 96 ウェル プレート システムを使用して実行されます。代表的なプロトコルを使用して示唆されたホスホリパーゼ D の活性が転写因子 TaABF1 を ABA によるHVA1遺伝子発現の活性化に重要な役割を果たす可能性があります。

Introduction

オオムギ糊粉層、植物1におけるホルモン調節遺伝子発現の研究の確立されたモデル システムです。特に、発芽や苗の早期開発のために必要な遺伝子の数はアブシジン酸 (ABA) によるストレス反応に関連する遺伝子が活性化しながらジベレリン (GA) によってアクティブ化されます。GA と ABA シグナル伝達経路が絡み合っている ABA および逆1にいくつか GA 活性化遺伝子の発現が阻害されると。

ジョージア州/ABA シグナル伝達経路で特定俳優の役割の結果を許可する記者の構成要素の過渡式に続いて、粒子の爆撃によってエフェクター遺伝子構造の導入をされている理解のための重要な戦略下流遺伝子発現が決定されます。ガス(β-グルクロニダーゼ) などルシフェラーゼレポーター遺伝子の使用エフェクター コンストラクトを受けた細胞内遺伝子発現の高感度で定量的に計測が可能します。たとえば、転写因子 TaABF15,6エフェクター コンストラクトの導入確立、ABA で誘導される遺伝子HVA1などによる TaABF1、 Amy32bなどの遺伝子の ga 処理で誘導しながら追加されなくなります。粒子衝突実験的戦略としては、ジョージア州/ABA シグナル伝達経路の多様な側面を調査する複数の研究所で使用されています。このような作業は、ga 処理で誘導2の ABA 誘導遺伝子3、活性化のため重要なプロモーター同定し、蛋白質キナーゼ4の発見につながっているし、転写因子を調節する5これらの遺伝子の表現。

既存プロトコル2,3,4,5,6パーティクルガンと一時的な遺伝子発現のそれに続く測定は、各一連の砲撃労働集約的、します。ほとんどの穀物は乳鉢と乳棒で手作業で均質化し、酵素試金は個別に実施します。この原稿は部分的に自動化および均質化手順を合理化する改善されたプロトコルを報告し、GUS のかなり多くのスループットを許可する試金の同じ実験でテストされる処置の多数を許可および/または、統計的に信頼性の高い結果を得るため、それぞれの治療のためより複製の包含。転写因子 TaABF1 および GA, ABA、およびその他の規制の分子によって規制されているHVA1Amy32bの記者構成要素の式の代表的な結果が表示されます。

Protocol

1. エフェクターとレポーターの遺伝子の準備を構築します。 目的の開いたリーディング ・ フレームからドライブ式に構成プロモーター (例えばトウモロコシ ユビキチン、 UBI) を採用しているエフェクターの構造を構築します。たとえば、TaABF1 の5ドライブ強い恒常発現するUBI::TaABF1を含んでいるプラスミッドを構築します。 ガスなどの開…

Representative Results

ここで説明する手法は、大麦アリューロン細胞に任意のテスト遺伝子コンストラクトを導入する使用ことができます。実験遺伝子の表現のレベルがあります便利な測定 (図 2)。ここで大きく説明より高いスループット プロトコルは、研削のシードと酵素試金のステップの効率を高めます。このメソッドは、ABA で誘導される遺伝子HVA1<sup cla…

Discussion

パーティクルガンによるエフェクター遺伝子の導入構築、記者構造の過渡式続いて GA/ABA シグナル伝達経路と結果ホルモン調節遺伝子で特定の俳優の役割を解剖するための重要な戦略式です。
ただし、大麦アリューロン細胞2,3,4,5,6でこのような実験を行うための既存?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、グレイソン バトラーとマーガレット ・ バレットを実験、ジュディ石粒の均質化についてのアドバイスを蛍光についてのアドバイスをリン ・ ハナムの遂行に助けに感謝します。この作品は全米科学財団 (IOB 0443676) 支えられた制度開発賞 (アイデア) から国立科学研究所の一般医療 [許可番号 P20GM0103423、健康の国民の協会からの補助金コルビー大学自然科学部

Materials

GeneElute HP plasmid Maxiprep kit Sigma NA0310-1KT
UV-vis spectrophotometer Nanodrop ND-1000
Himalaya barley grains / / A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C)
sodium succinate Sigma S2378 Reagent for Imbibing Solution
calcium chloride (dihydrate) Fisher C79-500 Reagent for Imbibing Solution
Imbibing Solution home made / 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use.
chloramphenicol Sigma C0378 Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol.
vermiculite Fisher NC0430369 Used for vermiculite plates.
filter paper circles (90 mm) Whatman 1001 090 Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation
Vermiculite Plates home made / Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave.
forceps (fine pointed) Fisher 13-812-42 Used for removing seed coat from barley grains.
forceps (ultra fine point) Fisher 12-000-122 Used for removing seed coat from barley grains.
gold microcarriers (1.6 μm) BioRad 1652264
macrocarriers BioRad 1652335
calcium chloride (dihydrate) Fisher C79-500 Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
spermidine Sigma S0266 Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months).
rupture discs (1550 psi) BioRad 1652331
stopping screens BioRad 1652336
macrocarrier holders BioRad 1652322
Biolistic particle delivery system BioRad PDS-1000/He
sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma S9638 Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
sodium phosphate dibasic Sigma S9763 Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
1M sodium phosphate pH 7.2 home made / Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2.
dithiothrietol (DTT) Sigma 43819 Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots.
leupeptin Sigma L2884 Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C.
glycerol Sigma G5516 Prepare a 50% solution in water.
Grinding Buffer home made / Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL.
stainlesss steel beads (5 mm) Qiagen 69989
2.0 mL tubes Eppendorf 22363352 This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer.
bead homogenizer (TissueLyser) Qiagen 85210
12mm x 75 mm glass test tubes Fisher
luciferin Goldbio LUCK-100 Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
ATP Sigma A7699 Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C.
Tris base Sigma T1503 Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
sulfuric acid Sigma 258105 Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
1M Tris sulfate pH 7.7 home made / Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid.
magnesium chloride Sigma M9397 Dissolve in water to 2 M.
Luciferase Assay Buffer (LAB) home made / Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL.
Luciferase Assay Mixture home made / Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays.
luminometer (Sirius) Berthold /
4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) Goldbio MUG1 Dissolve in DMSO to 100 mM.
sodium azide Sigma S8032 Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C.
96 well plates (standard) Fisher 12565501
GUS assay buffer home made / Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL.
TempPlate sealing film USA Scientific 2921-1000
96 well plates (black) Costar 3916
sodium carbonate Sigma S7795 Prepare a 200 mM solution in water.
4-methylumbelliferone Sigma M1381 Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C.
microplate fluouresence reader Bio-Tek FLX-800

References

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Cite This Article
Uwase, G., Enrico, T. P., Chelimo, D. S., Keyser, B. R., Johnson, R. R. Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput. J. Vis. Exp. (133), e56728, doi:10.3791/56728 (2018).

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