Summary

Messung der Genexpression in bombardierten Gerste Aleuronschicht Schichten mit erhöhter Durchsatz

Published: March 30, 2018
doi:

Summary

Eine verbesserte Protokoll ist für die Messung der transiente Genexpression von Reporter Konstrukte in Gerste Aleuronschicht Zellen nach Bombardement Teilchen vorgestellt. Die Kombination von automatisierten Getreide mahlen mit 96-Well-Platte Enzym-Assays bietet hohen Durchsatz für das Verfahren.

Abstract

Die Aleuronschicht Gerstenkörner ist ein wichtiges Modellsystem für Hormon-regulierten Genexpression in Pflanzen. In Aleuronschicht Zellen Gene benötigt zur Keimung oder frühe Sämling-Entwicklung werden aktiviert, indem Gibberellin (GA), während Gene zugeordnete Stressreaktionen durch Abscisic Säure (ABA) aktiviert werden. Die Mechanismen der GA und ABA Signalisierung können abgefragt werden, durch die Einführung von Reporter Genkonstrukte in Aleuronschicht Zellen über Teilchen-Bombardement, mit den daraus resultierenden transiente Expression mit Enzym-Assays gemessen. Eine verbesserte Protokoll wird berichtet, dass teilweise automatisiert und rationalisiert das Korn Homogenisierung Schritt und die Enzym-Assays, wodurch deutlich mehr Durchsatz als bestehende Methoden. Homogenisierung der Getreide Proben erfolgt über eine automatisierte Gewebe-Homogenisator und GUS (β-Glucuronidase) Assays werden mit Hilfe einer 96-Well-Platte-System durchgeführt. Repräsentative Ergebnisse über das Protokoll legen nahe, dass Phospholipase D Tätigkeit eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der HVA1 Genexpression von ABA, durch den Transkriptionsfaktor TaABF1 spielen kann.

Introduction

Die Aleuronschicht Gerste ist eine gut etablierte Modellsystem für das Studium der Hormon-regulierten Genexpression in Pflanzen1. Insbesondere werden eine Reihe von Genen, die für die Keimung oder frühe Sämling-Entwicklung durch Gibberellin (GA), aktiviert, während Gene zugeordnete Stressreaktionen durch Abscisic Säure (ABA) aktiviert werden. GA und ABA Signalwege sind miteinander verflochten, wie der Ausdruck einiger GA-aktivierten Gene von ABA und umgekehrt1gehemmt wird.

Eine sinnvolle Strategie für Verständnis, dass die Rolle von bestimmten Akteuren bei der Signalisierung GA/ABA wurde die Einführung der Effektor Genkonstrukte über Teilchen-Bombardement, gefolgt von transienten Expression Reporter Konstrukte, mit denen den daraus resultierende Effekt auf nachgeschalteten Genexpression bestimmt werden. Die Verwendung von Reporter-Gene wie GUS (β-Glucuronidase) oder Luciferase ermöglicht die sensible und quantitative Messung der Genexpression speziell innerhalb der Zellen, die die Effektor-Konstrukt erhalten haben. Zum Beispiel festgestellt die Einführung eines Effektor-Konstrukts Codierung der Transkriptionsfaktor TaABF15,6 , dass ABA-induzierten Genen wie HVA1 von TaABF1, beim GA-induzierten Genen wie Amy32b induziert werden werden unterdrückt. Teilchen-Bombardement als experimentelle Strategie wurde von mehreren Labors untersuchen verschiedene Aspekte des GA/ABA Signalisierung verwendet. Diese Arbeit führte zur Identifizierung der Promotor Elemente wichtig für die Aktivierung des GA-induzierte2 und ABA-induzierten Genen3und zur Entdeckung von Protein Kinasen4 und Transkription Faktoren5 , die Regeln der Expression dieser Gene.

Die vorhandenen Protokolle2,3,4,5,6 für Teilchen-Bombardement und Folgebewertung von transiente Genexpression sind sehr arbeitsintensiv, wie jede Gruppe von bombardiert kaum Getreide wird von Hand in einem Mörser und Stößel homogenisiert und die Enzym-Assays werden individuell durchgeführt. Diese Handschrift berichtet eine verbesserte Protokoll, das teilweise automatisiert und rationalisiert die Homogenisierung Schritt und der GUS assays um deutlich mehr Durchsatz ermöglichen eine größere Anzahl von Behandlungen im gleichen Experiment getestet werden bei schönem und/oder die Aufnahme von mehr Wiederholungen für jede Behandlung mehr statistisch solide Ergebnisse zu erzielen. Repräsentative Ergebnisse sind für den Ausdruck von HVA1 und Amy32b Reporter Konstrukte, reguliert durch den Transkriptionsfaktor TaABF1 sowie GA, ABA und andere regulatorische Moleküle dargestellt.

Protocol

1. Vorbereitung der Effektor und Reportergen konstruiert Effektor-Konstrukte, die konstitutiven Promoter (z. B. Mais Ubiquitin, UBI) beschäftigen Laufwerk Ausdruck aus einem gewünschten offenen Leseraster zu bauen. Beispielsweise erstellen Sie ein Plasmid mit UBI::TaABF1 Antrieb stark konstitutive Ausdruck des TaABF15. Reporter-Konstrukte, die der Veranstalter enthalten, deren Aktivität gemessen werden, soll, zu bauen, platziert einen offenen Leserahmen, wi…

Representative Results

Die hier beschriebene Technik kann verwendet werden, jeder Test Genkonstrukt in Aleuronschicht Zellen der Gerstenkörner einzuführen. Dann kann die Ebene des Ausdrucks aus dem Test-gen bequem gemessen (Abbildung 2). Die höheren Durchsatz Protokoll hier beschriebenen stark erhöht die Effizienz der Samen Schleifen und Enzym-Assay-Schritte. Diese Methode wurde zur Beurteilung der Fähigkeit der Transkription Faktor TaABF15,<…

Discussion

Die Einführung der Effektor gen konstruiert über Teilchen-Bombardement, gefolgt von transienten Expression Reporter Konstrukte ist eine sinnvolle Strategie für die Rolle von bestimmten Akteuren in GA/ABA Signalisierung und das daraus resultierende Hormon reguliert gen sezieren Ausdruck.
Allerdings sind die vorhandenen Protokolle für solche Experimente in Gerste Aleuronschicht Zellen2,3,4,5</su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Greyson Butler und Margaret Barrett für Hilfe bei der Durchführung der Experimente, Judy Stone für die Beratung über Korn Homogenisierung und Lynn Hannum für Beratung bei Fluorometry. Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (IOB 0443676), durch eine institutionelle Development Award (IDeA) aus dem National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health unter Grant-Nummer P20GM0103423 und durch Zuschüsse unterstützt. die Colby College Division der Naturwissenschaften.

Materials

GeneElute HP plasmid Maxiprep kit Sigma NA0310-1KT
UV-vis spectrophotometer Nanodrop ND-1000
Himalaya barley grains / / A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C)
sodium succinate Sigma S2378 Reagent for Imbibing Solution
calcium chloride (dihydrate) Fisher C79-500 Reagent for Imbibing Solution
Imbibing Solution home made / 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use.
chloramphenicol Sigma C0378 Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol.
vermiculite Fisher NC0430369 Used for vermiculite plates.
filter paper circles (90 mm) Whatman 1001 090 Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation
Vermiculite Plates home made / Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave.
forceps (fine pointed) Fisher 13-812-42 Used for removing seed coat from barley grains.
forceps (ultra fine point) Fisher 12-000-122 Used for removing seed coat from barley grains.
gold microcarriers (1.6 μm) BioRad 1652264
macrocarriers BioRad 1652335
calcium chloride (dihydrate) Fisher C79-500 Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
spermidine Sigma S0266 Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months).
rupture discs (1550 psi) BioRad 1652331
stopping screens BioRad 1652336
macrocarrier holders BioRad 1652322
Biolistic particle delivery system BioRad PDS-1000/He
sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma S9638 Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
sodium phosphate dibasic Sigma S9763 Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
1M sodium phosphate pH 7.2 home made / Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2.
dithiothrietol (DTT) Sigma 43819 Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots.
leupeptin Sigma L2884 Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C.
glycerol Sigma G5516 Prepare a 50% solution in water.
Grinding Buffer home made / Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL.
stainlesss steel beads (5 mm) Qiagen 69989
2.0 mL tubes Eppendorf 22363352 This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer.
bead homogenizer (TissueLyser) Qiagen 85210
12mm x 75 mm glass test tubes Fisher
luciferin Goldbio LUCK-100 Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
ATP Sigma A7699 Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C.
Tris base Sigma T1503 Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
sulfuric acid Sigma 258105 Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
1M Tris sulfate pH 7.7 home made / Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid.
magnesium chloride Sigma M9397 Dissolve in water to 2 M.
Luciferase Assay Buffer (LAB) home made / Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL.
Luciferase Assay Mixture home made / Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays.
luminometer (Sirius) Berthold /
4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) Goldbio MUG1 Dissolve in DMSO to 100 mM.
sodium azide Sigma S8032 Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C.
96 well plates (standard) Fisher 12565501
GUS assay buffer home made / Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL.
TempPlate sealing film USA Scientific 2921-1000
96 well plates (black) Costar 3916
sodium carbonate Sigma S7795 Prepare a 200 mM solution in water.
4-methylumbelliferone Sigma M1381 Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C.
microplate fluouresence reader Bio-Tek FLX-800

References

  1. Chen, K., An, Y. Q. C. Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone. J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).
  2. Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters. Plant Cell. 4, 203-211 (1992).
  3. Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression. Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).
  4. Gómez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules. Plant Cell. 13, 667-679 (2001).
  5. Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells. Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).
  6. Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains. Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).
  7. Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare). Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).
  8. Ritchie, S., Gilroy, S. Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).
  9. Takemiya, A., Shimazaki, K. Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1. Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).
  10. Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway. J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).
  11. Ishibashi, Y., et al. Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells. Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).
  12. Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
  13. Hong, J. Y., et al. Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor. Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).
  14. Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination. Plant J. 32, 317-328 (2002).
  15. Zhou, X., et al. SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5. Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).
  16. Zong, W., et al. Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes. Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).

Play Video

Cite This Article
Uwase, G., Enrico, T. P., Chelimo, D. S., Keyser, B. R., Johnson, R. R. Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput. J. Vis. Exp. (133), e56728, doi:10.3791/56728 (2018).

View Video