Summary

قياس التعبير الجيني في طبقات الارون الشعير قصفت مع زيادة الإنتاجية

Published: March 30, 2018
doi:

Summary

ويرد بروتوكولا محسنة لقياس التعبير الجيني عابرة من ثوابت مراسل في الخلايا الارون الشعير بعد قصف الجسيمات. مزيج الحبوب الآلي طحن مع فحوصات إنزيم لوحة 96-جيدا يوفر إنتاجية عالية لهذا الإجراء.

Abstract

الطبقة الارون الحبوب الشعير نظام نموذجا هاما للتعبير الجيني ينظم هرمون في النباتات. في الخلايا الارون، الجينات المطلوبة للإنبات أو يتم تنشيط التنمية الشتلات في وقت مبكر من جبرلين (GA)، في حين يتم تنشيط الجينات المرتبطة باستجابات الإجهاد من حمض التسقيط (ABA). يمكن استجوابهم آليات GA وأبا إشارات بإدخال ثوابت الجينات مراسل الارون الخلايا عن طريق القصف الجسيمات، مع تعبير عابر الناتجة تقاس باستخدام فحوصات إنزيم. وضع بروتوكول تحسين يقال أن جزئيا بأتمتة ويبسط خطوة التجانس الحبوب وفحوصات إنزيم، السماح بإنتاجية أكبر بكثير من الأساليب القائمة. تجانس عينات الحبوب يجري استخدام الخالطون نسيج الآلي، وفحوصات غوس (β-جلوكورونيداسي) وتنفذ باستخدام نظام لوحة 96-جيدا. نتائج تمثيلية باستخدام البروتوكول تشير إلى أن النشاط phospholipase د قد تلعب دوراً مهما في تنشيط الجينات HVA1 برابطة المحامين الأمريكية، من خلال عامل النسخ TaABF1.

Introduction

طبقة الارون الشعير نظام نموذجي راسخة لدراسة التعبير الجيني ينظم هرمون في النباتات1. على وجه الخصوص، يتم تنشيط عدد من الجينات المطلوبة للإنبات أو الشتلات المبكرة من جبرلين (GA)، في حين يتم تنشيط الجينات المرتبطة باستجابات الإجهاد من حمض التسقيط (ABA). تتشابك GA وأبا إشارات المسارات، كما تحول دون التعبير عن بعض الجينات تنشيط الجمعية العامة برابطة المحامين الأمريكية، والعكس بالعكس1.

استراتيجية قيمة لفهم دور الأطراف الفاعلة خاصة في الإشارات GA/أبا قد تم الأخذ بنيات الجينات المستجيب عبر قصف الجسيمات، متبوعاً بالتعبير عابر للمراسل بنيات تسمح بذلك من الأثر على التعبير الجيني المتلقين للمعلومات تحديد. يسمح استخدام الجينات مراسل مثل غوس (β-جلوكورونيداسي) أو لوسيفراس قياس الكمية وحساسة للتعبير الجيني على وجه التحديد داخل الخلايا التي حصلت في بناء المستجيب. على سبيل المثال، أنشأت الأخذ ببناء المستجيب ترميز عامل النسخ5،TaABF16 أن الجينات التي يسببها أبا مثل HVA1 هي الناجمة عن TaABF1، بينما الجينات التي يسببها GA مثل Amy32b يتم قمعها. قد استخدمت القصف الجسيمات كاستراتيجية تجريبية بمختبرات متعددة للتحقيق في الجوانب المتنوعة لإشارات GA/أبا. مثل هذا العمل قد أدى إلى تحديد عناصر المروج هامة لتفعيل المستحثة ألجأ2 والجينات التي يسببها أبا3، وإلى اكتشاف بروتين مؤنزم4 وعوامل النسخ5 التي تنظم التعبير عن هذه الجينات.

القائمة بروتوكولات2،3،4،5،6 لقصف الجسيمات وقياس اللاحقة للتعبير الجيني عابرة هي تماما العمل المكثف، كما قصفت كل مجموعة هو تجانس بالكاد من الحبوب باليد بقذائف الهاون والمدقة وتجري فحوصات إنزيم على حدة. تقارير هذه المخطوطة هو بروتوكول تحسين جزئيا بأتمتة ويبسط خطوة التجانس وفحوصات جوس للسماح بإنتاجية أكبر بكثير، السماح لعدد أكبر من العلاجات لفحصها بالتجربة نفسها، و/أو إدراج replicates أكثر لكل معاملة للحصول على المزيد من النتائج إحصائيا قويا. وتظهر نتائج تمثيلية للتعبير عن نيات مراسل HVA1 و Amy32b ، وينظم على عامل النسخ TaABF1 وكذلك الجمعية العامة، وأبا، والجزيئات التنظيمية الأخرى.

Protocol

1-إعداد المستجيب والجينات مراسل بنيات بناء المستجيب بنيات التي توظف مروج تأسيسي (مثل الذرة أوبيكويتين، يو بي أي) إلى التعبير بالسيارة من إطار المطلوب قراءة مفتوحة. على سبيل المثال، بناء بلازميد يحتوي على UBI::TaABF1 إلى محرك قوي التعبير التأسيسي من TaABF15. بناء بن…

Representative Results

يمكن استخدام الأسلوب الموصوفة هنا لإدخال أي بناء اختبار الجينات في الخلايا الارون الحبوب الشعير. ثم قد يكون مستوى التعبير عن الجين اختبار قياس ملائم (الشكل 2). البروتوكول إنتاجية أعلى الموصوفة هنا إلى حد كبير يزيد من كفاءة طحن البذور والخطوات إنزيم المقاي…

Discussion

بنيات إدخال الجينات المستجيب عبر قصف الجسيمات، متبوعاً بالتعبير عابرة من بنيات مراسل استراتيجية قيمة لتشريح دور الأطراف الفاعلة خاصة في الإشارات GA/أبا والجين ينظم هرمون الناتجة التعبير.
ومع ذلك، هي البروتوكولات القائمة لإجراء مثل هذه التجارب في الشعير الارون الخلايا2،<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون غريسون بتلر ومارغريت باريت للمساعدة في القيام التجارب وستون جودي لإسداء المشورة بشأن التجانس الحبوب هانوم لين لإسداء المشورة بشأن فلوروميتري. هذا العمل كان تدعمها المؤسسة الوطنية للعلوم (0443676 المعهد المصرفي)، “جائزة التنمية المؤسسية” (فكرة) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة “المعاهد الوطنية للصحة” تحت رقم المنحة P20GM0103423، والمنح المقدمة من كلية كولبي شعبة العلوم الطبيعية.

Materials

GeneElute HP plasmid Maxiprep kit Sigma NA0310-1KT
UV-vis spectrophotometer Nanodrop ND-1000
Himalaya barley grains / / A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C)
sodium succinate Sigma S2378 Reagent for Imbibing Solution
calcium chloride (dihydrate) Fisher C79-500 Reagent for Imbibing Solution
Imbibing Solution home made / 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use.
chloramphenicol Sigma C0378 Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol.
vermiculite Fisher NC0430369 Used for vermiculite plates.
filter paper circles (90 mm) Whatman 1001 090 Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation
Vermiculite Plates home made / Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave.
forceps (fine pointed) Fisher 13-812-42 Used for removing seed coat from barley grains.
forceps (ultra fine point) Fisher 12-000-122 Used for removing seed coat from barley grains.
gold microcarriers (1.6 μm) BioRad 1652264
macrocarriers BioRad 1652335
calcium chloride (dihydrate) Fisher C79-500 Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
spermidine Sigma S0266 Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months).
rupture discs (1550 psi) BioRad 1652331
stopping screens BioRad 1652336
macrocarrier holders BioRad 1652322
Biolistic particle delivery system BioRad PDS-1000/He
sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma S9638 Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
sodium phosphate dibasic Sigma S9763 Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
1M sodium phosphate pH 7.2 home made / Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2.
dithiothrietol (DTT) Sigma 43819 Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots.
leupeptin Sigma L2884 Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C.
glycerol Sigma G5516 Prepare a 50% solution in water.
Grinding Buffer home made / Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL.
stainlesss steel beads (5 mm) Qiagen 69989
2.0 mL tubes Eppendorf 22363352 This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer.
bead homogenizer (TissueLyser) Qiagen 85210
12mm x 75 mm glass test tubes Fisher
luciferin Goldbio LUCK-100 Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
ATP Sigma A7699 Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C.
Tris base Sigma T1503 Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
sulfuric acid Sigma 258105 Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
1M Tris sulfate pH 7.7 home made / Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid.
magnesium chloride Sigma M9397 Dissolve in water to 2 M.
Luciferase Assay Buffer (LAB) home made / Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL.
Luciferase Assay Mixture home made / Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays.
luminometer (Sirius) Berthold /
4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) Goldbio MUG1 Dissolve in DMSO to 100 mM.
sodium azide Sigma S8032 Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C.
96 well plates (standard) Fisher 12565501
GUS assay buffer home made / Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL.
TempPlate sealing film USA Scientific 2921-1000
96 well plates (black) Costar 3916
sodium carbonate Sigma S7795 Prepare a 200 mM solution in water.
4-methylumbelliferone Sigma M1381 Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C.
microplate fluouresence reader Bio-Tek FLX-800

References

  1. Chen, K., An, Y. Q. C. Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone. J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).
  2. Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters. Plant Cell. 4, 203-211 (1992).
  3. Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression. Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).
  4. Gómez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules. Plant Cell. 13, 667-679 (2001).
  5. Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells. Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).
  6. Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains. Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).
  7. Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare). Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).
  8. Ritchie, S., Gilroy, S. Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).
  9. Takemiya, A., Shimazaki, K. Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1. Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).
  10. Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway. J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).
  11. Ishibashi, Y., et al. Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells. Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).
  12. Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
  13. Hong, J. Y., et al. Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor. Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).
  14. Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination. Plant J. 32, 317-328 (2002).
  15. Zhou, X., et al. SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5. Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).
  16. Zong, W., et al. Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes. Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).

Play Video

Cite This Article
Uwase, G., Enrico, T. P., Chelimo, D. S., Keyser, B. R., Johnson, R. R. Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput. J. Vis. Exp. (133), e56728, doi:10.3791/56728 (2018).

View Video